研究背景放射治疗通过增加肿瘤免疫原性和肿瘤微环境重编程来克服免疫治疗耐药,免疫检查点抑制剂通过提高T淋巴细胞功能增强了放射治疗引起的远隔效应。越来越多的临床试验和临床前实验表明,免疫治疗联合放射治疗（Immune-radiotherapy,iRT）优于单独放射治疗或者免疫治疗的效果,可以发挥1+1＞2的联合效应。淋巴结是重要的次级淋巴器官,调节B淋巴细胞、T淋巴细胞和抗原呈递细胞等多种免疫细胞的相互作用和运输。肿瘤引流淋巴结（Tumor-draining lymph nodes,TDLNs）是放射治疗介导的免疫刺激和远隔效应的关键。通常认为程序性死亡受体1（Programmed cell death protein 1,PD-1）和程序性死亡受体-配体 1（Programmed cell death-ligand 1,PD-L1）免疫检查点阻断治疗可以激活肿瘤免疫微环境（Tumor immunity in the microenvironment,TIME）中的T淋巴细胞,但有文献报道PD-L1抗体可以在TDLNs中发挥作用。肿瘤放射治疗后,初始T淋巴细胞在TDLNs中被成熟树突状细胞（Dendritic cell,DC）激活;在TDLNs功能丧失的情况下,放射治疗诱导的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞功能受到影响。目前已有部分研究证明由手术、放射治疗、药物抑制剂或基因缺失引起的TDLNs功能障碍显著减弱了放射治疗或免疫治疗的抗肿瘤作用。选择性TDLNs放疗可调节趋化因子信号转导引起肿瘤内免疫浸润减少,导致肿瘤内效应性CD8+T淋巴细胞/调节性T淋巴细胞（RegulatoryT cell,Treg）比值下降。然而,TDLNs在iRT诱导的远隔效应中的作用及机制尚不清楚。TDLNs是肿瘤抗原提呈的主要部位,在大多数情况下也是转移的来源。因此,TDLNs中免疫细胞的类型和功能对TIME至关重要,并可能影响肿瘤的临床转归。不同的淋巴细胞进入TIME调节抗肿瘤免疫反应,免疫细胞的特定亚群已被确定为抗肿瘤作用中的关键驱动因素,如CD8+T淋巴细胞、肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associatedmacrophages,TAMs）、髓源抑制性细胞（Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）等。免疫效应分子在TIME中的高效募集是决定抗肿瘤免疫治疗成功的关键因素之一,特别是肿瘤特异性CD8+T淋巴细胞的激活。然而,TDLNs在iRT治疗中的作用及机制尚不明确。为了探究TDLNs在调节免疫细胞影响iRT治疗效果中的作用及机制,我们提出以下科学假说:TDLNs通过调节TIME促进iRT诱导的抗肿瘤作用。为了验证这一假说,我们建立了小鼠的原发及远隔肿瘤模型及TDLNs切除模型,在小鼠模型中评估不同TDLNs状态下iRT治疗后原发和远隔肿瘤TIME中免疫细胞的变化,并在临床资料中进一步验证了 TDLNs对患者预后的重要作用。研究目的1.探讨TDLNs在放射治疗、免疫治疗及iRT治疗时对原发和远隔肿瘤的作用。2.探讨TDLNs在iRT的抗肿瘤及远隔效应中发挥作用的机制。3.通过患者资料分析,验证TDLNs对患者预后的重要作用。研究方法第一部分:小鼠TDLNs在iRT治疗中的作用研究采用小鼠结肠癌MC38细胞、皮肤黑色素瘤B16F10细胞建立小鼠的单侧皮下肿瘤模型,随机分为9组,在TDLNs存在或者切除的情况下分别给与放射治疗、Anti-PD-1治疗和iRT治疗,明确iRT对原发和远隔肿瘤的作用。随后建立FTY720药物处理小鼠模型,阻断T淋巴细胞从淋巴组织中的输出,抑制淋巴结在免疫中发挥作用的途径。验证了 TDLNs在iRT诱导的抗肿瘤反应中的作用。进一步建立上述2种细胞系的小鼠双侧皮下肿瘤模型,随机分为20组,分别验证切除小鼠的原发侧、远隔侧和双侧TDLNs时,分别给与放射治疗、Anti-PD-1治疗和iRT治疗后,小鼠的原发和远隔肿瘤的治疗效果。确定不同部位TDLNs在小鼠原发肿瘤的抗肿瘤作用和远隔肿瘤的远隔效应中的作用。第二部分:TDLNs在调节肿瘤免疫微环境影响iRT治疗效果中的机制研究为确定TDLNs在iRT治疗中发挥作用的机制,我们在iRT治疗后1、3、5和7天分别取小鼠原发侧和远隔侧的TDLNs进行RNA-Seq,分析差异表达基因及信号通路变化,并通过流式细胞分析iRT治疗后不同时间TDLNs中免疫细胞的分布,明确iRT治疗后TDLNs中发挥作用的免疫细胞亚群,并提出TDLNs可能发挥作用的机制。为了明确TDLNs切除对iRT治疗引起的原发及远隔肿瘤TIME的变化,我们提取了肿瘤中浸润淋巴细胞（Tumor infiltrating lymphocyte,TIL）进行 RNA-Seq 及 Nanostring分析,发现不同TDLNs状态下给与iRT治疗时,基因表达及信号通路富集差异主要集中在CD8+T淋巴细胞和TAMs。利用流式细胞分析技术和多色免疫荧光技术,明确肿瘤TIME中CD8+T淋巴细胞的分布及免疫效应因子的变化、TAMs极化在iRT治疗中的作用。进一步给与小鼠Anti-CD8+T淋巴细胞抗体进行耗竭实验,验证了 CD8+T淋巴细胞在iRT治疗中的关键作用。第三部分:乳腺癌患者术中淋巴结切除数目与患者预后的相关性分析收集SEER数据库中2011年1月-2011年12月被诊断为乳腺癌并接受手术的患者42557例。排除腋窝淋巴结切除数目不明确及腋窝淋巴结存在转移的患者,最终入组患者24464例。随访时间截止到2018年。终点事件为总生存和乳腺癌特异性生存。使用X-Tile软件分析找出阴性淋巴结个数分组的合适临界点,生存曲线绘制使用Kaplan-Meier生存分析方法。通过SPSS19.0对数据进行统计分析,组间差异使用Log-rank检验。定义p＜0.05为有统计学差异。回顾性分析2013年4月至2020年3月在山东省肿瘤医院初诊并接受保乳手术且腋窝淋巴结无转移的乳腺癌患者220例。分析患者手术前后血常规的变化。根据腋窝淋巴结切除的数目分为2组,分别研究淋巴结切除不同数目时,患者白细胞计数、淋巴细胞计数、中性粒细胞计数、单核细胞计数、血小板计数术前术后的结果差异,使用SPSS19.0对数据进行分析,具体使用非参数秩和检验Mann-Whitney检验的方法。定义p＜0.05为有统计学差异。研究结果第一部分:小鼠TDLNs在iRT治疗中的作用研究1.确定小鼠TDLNs的位置和放疗方式小鼠肿瘤部位皮下注射医用亚甲蓝进行TDLNs染色以确定TDLNs在我们建立的肿瘤模型中的位置。未使用亚甲蓝染色小鼠的同样位置处发现透亮淋巴结,完整切除后经病理科医生会诊为完整的淋巴结结构,表明我们的小鼠TDLNs切除模型构建成功。在小鼠TDLNs切除手术或假性切除手术后的第2天,小鼠麻醉后使用生物学X射线辐照仪对小鼠原发性肿瘤（左侧）进行12Gy单次的垂直照射。小鼠除肿瘤外的其他身体部位均由4mm厚的定制铅块屏蔽保护。本实验中所有动物模型涉及到的小鼠肿瘤放射治疗均采用此方法。2.单侧小鼠移植瘤模型验证iRT引起的抗肿瘤作用依赖于完整的TDLNs在单侧皮下成瘤的MC38和B16F10细胞荷瘤小鼠模型中,切除或不切除TDLNs的情况下接受单一疗法（放射治疗或Anti-PD-1治疗）或iRT。结果显示:与放射治疗组或Anti-PD-1治疗相比,iRT组的抗肿瘤作用明显增强,并且iRT组的抗肿瘤作用均明显优于iRT+Resection组。我们的研究表明iRT诱导的抗肿瘤作用需要完整的TDLNs。基于以上实验结果,得出结论:TDLNs是iRT促进抗肿瘤反应的重要枢纽。3.FTY720药物明确TDLNs在iRT治疗中的作用在对照组和iRT组分别给与FTY720药物联合治疗,在给与放射治疗48h后,取小鼠外周血,流式细胞仪分析外周血中CD3+T淋巴细胞的表达水平,发现FTY720的应用显著降低了外周血中的T淋巴细胞。肿瘤生长曲线发现FTY720药物处理明显减弱了iRT诱导的抗肿瘤作用。进一步验证了 TDLNs是iRT引起的抗肿瘤反应的重要中枢。4.iRT引起的远隔效应依赖于完整的TDLNs在已经建立的双侧小鼠荷瘤模型中,验证TDLNs在iRT引起的远隔效应中的作用。手术切除单侧或双侧TDLNs,验证不同部位TDLNs在不同治疗方法诱导的抗肿瘤效应和远隔效应中的作用。我们发现,双侧TDLNs的切除明显减弱了 iRT联合治疗时原发肿瘤的抗肿瘤作用和远隔肿瘤的远隔效应。第二部分:TDLNs在调节肿瘤免疫微环境影响iRT治疗效果中的作用研究1.iRT治疗后TDLNs表达谱的变化为了明确TDLNs在iRT治疗中的作用,我们在iRT治疗后1、3、5和7天分别取小鼠原发侧和远隔侧的TDLNs进行RNA-Seq,发现原发和远隔肿瘤TDLNs在iRT治疗后不同时间点,基因和富集的信号通路具有明显差异。原发和远隔侧肿瘤的TDLNs可能通过不同的机制以时间依赖性方式促进抗肿瘤免疫反应。TDLNs在iRT治疗中具体发挥作用的机制需要我们进一步实验去验证。2.iRT治疗促进TDLNs中干细胞样CD8+T淋巴细胞增加为了明确TDLNs在iRT治疗中发挥作用的免疫细胞亚群,我们在iRT治疗后不同时间分别取TDLNs进行流式细胞分析免疫细胞分布的变化。我们发现不管是原发侧还是远隔侧的TDLNs,随着iRT治疗后的时间增加,CD8+T淋巴细胞并没有明显的变化,但是干细胞样TCF1+Tim3-PD-1+CD8+CD45+T淋巴细胞亚群明显升高,随后下降并逐渐恢复至正常水平,这表明TDLNs中的干细胞亚群可能在iRT治疗中发挥重要作用,具体机制还需要进一步对肿瘤组织中的免疫细胞进行分析。3.TDLNs切除导致iRT治疗后肿瘤组织的TIL基因表达发生变化为了评估iRT对TIL的影响,我们在iRT治疗后7天从原发和远隔肿瘤中分离出TIL,并进行RNA-Seq分析。我们发现,TDLNs存在和切除时,原发和远隔肿瘤的TIL在iRT后CD8+T淋巴细胞和巨噬细胞的表达具有明显的统计学差异。双侧TDLNs切除可能影响iRT介导的T淋巴细胞反应和TAMs极化,具体机制需要进一步验证。4.TDLNs切除导致肿瘤iRT治疗后TIL免疫相关通路富集减少为了进一步明确双侧TDLNs切除影响iRT介导的T淋巴细胞反应和TAMs极化的具体机制,我们对RNA-Seq结果进行了 KEGG信号通路分析。我们发现在原发肿瘤TIL的RNA测序结果中,分别分析iRT组vs对照组和iRT组vs iRT+Res组明显增加的信号通路富集,相同的信号通路为细胞因子-细胞因子受体相关通路和吞噬体相关通路。同样的方法,在远隔肿瘤中,发现与免疫调节相关的趋化因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体通路。值得注意的是,iRT治疗后远隔肿瘤的TIL中代谢和氧化磷酸化通路显著上调,并且在TDLNs切除后下调,这说明原发和远隔肿瘤中的TIME之间存在差异。5.TDLNs切除减弱了 CD8+T淋巴细胞介导的抗肿瘤免疫反应首先建立小鼠的单侧MC38细胞肿瘤模型,在存在或不存在TDLNs的情况下对其进行放射治疗和/或Anti-PD-1治疗,流式细胞术分析发现iRT诱导的CD8+T淋巴细胞浸润依赖于完整的TDLNs。进一步建立小鼠的双侧MC38肿瘤细胞模型,并在手术切除或假性手术切除双侧TDLNs的情况下进行iRT治疗。流式细胞分析及多色荧光染色实验发现:单独切除TDLNs不影响未经iRT治疗的原发或远隔肿瘤TIME中的CD45+T和CD8+T淋巴细胞浸润。iRT治疗导致CD8+T淋巴细胞和CD45+T淋巴细胞的浸润显著增加,而TDLNs切除降低了 CD8+T淋巴细胞和CD45+T淋巴细胞的浸润。iRT导致原发和远隔肿瘤中IFNγ+和GranzymeB+T淋巴细胞显著富集,而这种富集在TDLNs手术切除后明显减少。并通过Anti-CD8抗体耗竭实验进一步验证了 CD8+T淋巴细胞的作用。6.iRT治疗后TDLNs在原发和远隔TIME中维持TAMs的极化通过Nanostring分析方法对转录组测序的结果进行分析,我们发现M1、M2型TAMs在iRT与iRT+Res组中表达明显不同。使用小鼠的双侧MC38细胞系肿瘤模型进一步验证iRT治疗时,不同的TDLNs存在状态对TIME中髓系细胞浸润的影响。相较于PMN-MDSC、M-MDSC和DCs在原发和远隔肿瘤中的不同变化,TAMs在原发肿瘤和远隔肿瘤中的浸润均因iRT治疗而减少,而TDLNs的切除逆转了这一减少趋势。在原发肿瘤中,与单独的iRT相比,iRT+Res组导致M1型TAMs的富集较少,M2型TAMs富集没有显著变化,但是CD86+M1/CD206+M2和MHCⅡ+M1/CD206+M2比率显着上调。在远隔肿瘤中,iRT治疗没有改变M1和M2型TAMs的富集改变,但是CD86+M1/CD206+M2的比率显著上调。多色免疫荧光染色技术分析原发和远隔肿瘤中TAMs标记蛋白的表达,与流式细胞术的结果一致,在iRT+Res组,原发和远隔肿瘤中检测到M1型TAMs的浸润减少和M2型TAMs的浸润增加。第三部分:乳腺癌患者术中淋巴结切除的数目与患者预后的相关性分析1.SEER数据库临床资料数据显示术中淋巴结切除数目与患者预后相关分析SEER数据库中腋窝淋巴结未转移的乳腺癌患者的临床资料,使用X-Tile软件分析出与患者生存相关的腋窝淋巴结切除数目临界值为6。根据临界值将患者分为2组,其中切除数目≤6组和切除数目＞6组。入组患者以Ⅰ、Ⅱ期为主,分别占全部患者的72.61%和24.66%。从分子分型来看,LuminalA型患者最多,占71.10%。不同阴性淋巴结切除数目的2组之间分子分型无统计学差异。我们发现相较于淋巴结切除数目少的患者,淋巴结切除数目多的患者预后较差。2.淋巴结过度切除引起患者术后淋巴细胞计数减少分析山东省肿瘤医院入组的220例乳腺癌患者资料。我们发现,随着淋巴结切除数目的增加,术后淋巴细胞计数-术前淋巴细胞计数的差值越来越小,而单核细胞在淋巴结切除数目为1-11枚时,差值均无统计学差异。随着淋巴结切除数目的增加,患者术后淋巴细胞计数具有减少趋势,而白细胞计数、中性粒细胞计数、单核细胞计数、血小板计数的术前术后结果无统计学差异。结论1.iRT治疗的抗肿瘤作用优于单独放射治疗或者Anti-PD-1的抗肿瘤作用;与单独放射治疗或者Anti-PD-1治疗相比,iRT治疗诱导更明显的远隔效应;完整的TDLNs是iRT诱导的原发和远隔肿瘤的抗肿瘤作用所必须的。2.在TDLNs存在的情况下,iRT治疗引起功能性CD8+T淋巴细胞富集增加,M1型TAMs在原发和远隔肿瘤中的浸润增加,抗肿瘤作用增加;手术切除TDLNs之后,原发和远隔肿瘤TIME中CD8+T淋巴细胞的富集减少,并伴随M2型TAMs的极化增加,减弱了 iRT诱导的抗肿瘤作用。3.更广泛的淋巴结切除术引起的淋巴细胞减少可能影响患者的预后。癌症患者通常会因癌症本身或治疗而引起免疫功能的低下,因此在临床淋巴结阴性的前提下,对于后续可能接受放射治疗和或免疫治疗的患者,保留淋巴结可能对预后有益。创新性及意义1.利用手术切除TDLNs的方法,成功构建了小鼠TDLNs缺失模型,分别证实了原发肿瘤侧和远隔肿瘤侧的TDLNs在放射治疗、Anti-PD-1治疗、iRT治疗诱导的远隔效应中的重要作用。2.iRT作为目前已经被广泛认可的联合治疗抗肿瘤模式,TDLNs在其中发挥的具体作用及机制缺乏相关研究证实。我们的实验通过建立小鼠远隔肿瘤模型,阐明了 TDLNs在iRT中主要通过调节TIME中CD8+T淋巴细胞的激活和TAMs极化发挥作用。3.癌症患者通常会因癌症本身或治疗而引起免疫功能的低下,因此在临床淋巴结阴性的前提下,对于后续可能接受放射治疗和或免疫治疗的患者,保留淋巴结可能对预后有益。我们通过本院临床资料,结合SEER数据库大数据分析,证实了淋巴结在患者预后中的重要作用,为临床评估为低危的患者避免过度淋巴结切除提供了理论基础。局限性1.小鼠与人类的遗传学背景存在一定的相似性,但是小鼠的免疫系统与人并不完全一致。小鼠后背部原发和远隔肿瘤模型分别位于小鼠后背部左侧和右侧,我们进行左侧、右侧和双侧TDLNs切除实验明确了原发和远隔侧TDLNs均完整,特别是原发肿侧TDLNs的完整性对iRT治疗的重要性。然而,对于临床上的患者,原发和转移肿瘤部位TDLNs的研究,还需要更多临床数据的支持。2.本研究检测了 iRT治疗后不同时间段原发和远隔侧TDLNs的转录组水平表达差异和免疫细胞分布,并进一步分析了 TDLNs不同状态时iRT治疗对原发和远隔肿瘤TIME的影响。但是,TDLNs具体通过什么机制影响TIME中CD8+T淋巴细胞的激活和TAMs极化发挥作用,没有进行更加深入的研究,具体机制需要后续实验进一步验证。3.由于在临床实践中不存在与我们基础实验中所提到的不同的淋巴结切除状态给与iRT治疗情况一致的患者,没有给与iRT治疗的患者资料。因此,在临床资料分析部分,我们仅选择了不同腋窝淋巴结切除状态的乳腺癌患者进行临床资料分析来明确淋巴结存在状态与患者预后的关系。