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目的:瘢痕疙瘩是伤口愈合中组织修复的必然结果,因此,抑制瘢痕疙瘩的形成一直是临床上的难点。然而驴皮含有大量的胶原纤维,在伤口愈合时会产生大量的胶原蛋白,但其伤口不会因为胶原蛋白的过度沉积而形成增生性瘢痕疙瘩。本研究在体外培养的驴皮肤成纤维细胞中添加硫酸钠、5-FU,分别筛选其合适的作用浓度与时间。然后,在新疆驴皮肤上建立伤口,并分别外敷硫酸钠、注射5-FU,以探讨此两种药物对肉芽期伤口愈合的作用,同时从分子学角度初步分析影响胶原蛋白合成的调控机制。方法:(1)采用组织块法体外培养驴皮肤成纤维细胞,并分别用HE、Masson、免疫化学染色进行细胞鉴定;再用添加了高浓度组(2000μg/m L、1500μg/m L)、中浓度组(1000μg/m L、500μg/m L、250μg/m L)和低浓度组(100μg/m L、50μg/m L、10μg/m L)硫酸钠、5-FU培养液分别体外培养驴皮肤成纤维细胞,用MTT和Caspase-3法分别检测细胞增殖率和凋亡率。最后分别用RT-q PCR、ELISA法检测不同浓度硫酸钠、5-FU培养液中,影响驴皮肤成纤维细胞合成胶原蛋白的相关基因表达量及蛋白浓度。(2)选取6只新疆母驴,建立驴皮肤伤口,每头驴沿背部脊柱两侧共取六个直径为1.5 cm大小的圆形伤口,伤口间的距离大于30 cm,其中同侧三个伤口为处理组,另一侧三个伤口为对照组,创伤后第三天开始给药。分别于创伤后0 d、7 d、17 d、100 d测量计算创面愈合率,HE染色观察创面组织学变化,Masson染色观察创面胶原纤维的增生情况,RT-q PCR、ELISA法检测TGF-β信号通路中部分关键基因smad7、smad3、COL3A1、COL1A1、COL1A2和TGF-β1基因在驴伤口皮肤内的表达差异。结果:(1)驴皮肤成纤维细胞培养5 d后,开始从组织块边缘爬出、25 d后长满整个培养皿;经HE、Masson及免疫化学染色鉴定,驴皮肤成纤维细胞培养成功。添加中浓度组的硫酸钠培养液对成纤维细胞的增殖率显著高于高、低浓度组(P<0.05),相应地,中浓度组的凋亡率显著低于其他两组(P<0.05)。相比于24 h,硫酸钠作用于成纤维细胞48 h能显著提高胶原蛋白合成相关基因的表达量(P<0.05),250μg/m L浓度的效果最佳。(2)高、中浓度组的5-FU培养液对抑制成纤维细胞增殖率显著高于其它组(P<0.05),相应地,低浓度组的凋亡率显著低于其他两组(P<0.05)。相比于12 h,5-FU作用于成纤维细胞24 h能显著抑制胶原蛋白合成相关基因的表达量(P<0.05),100μg/m L浓度的效果最佳。(3)与对照组相比,硫酸钠组加快了驴皮肤伤口愈合的速度,缩短肉芽期伤口愈合时间,7 d、17 d时硫酸钠组的创面愈合率均显著高于对照组(P<0.05),100 d时硫酸钠组表面有瘢痕疙瘩;伤口组织HE、Masson染色后,硫酸钠组胶原结构较致密,纤维束较粗大且排列紊乱;硫酸钠组smad3、COL3A1、COL1A1、COL1A2和TGF-β1基因相对表达量显著升高(P<0.05),smad7基因显著降低(P<0.05);硫酸钠组COL1A1、COL1A2、TGF-β1蛋白浓度也显著高于对照组(P<0.05)。(4)与对照组比,5-FU组创面肉芽期时收缩较慢且伤口愈合率小,100 d时5-FU组表面无瘢痕疙瘩;HE、Masson染色后,5-FU组胶原密度下降且间隙变宽,纤维束排列有序;5-FU组smad3、COL3A1、COL1A1、COL1A2和TGF-β1基因相对表达量显著下降(P<0.05),smad7相对表达量显著上升(P<0.05);5-FU组COL1A1、COL1A2、TGF-β1蛋白浓度也显著低于对照组(P<0.05)。结论:(1)250μg/m L硫酸钠培养液培养驴皮肤成纤维细胞48 h,能显著提高细胞增殖率,促进细胞信号通路相关基因合成胶原蛋白。(2)100μg/m L 5-FU培养24 h,可有效抑制成纤维细胞的增殖,抑制细胞信号通路相关基因合成胶原蛋白。(3)驴皮伤口外敷硫酸钠可加快伤口愈合的速度,缩短肉芽期伤口愈合的时间,但愈合后形成瘢痕疙瘩,上调TGF-β/smad信号通路相关基因m RNA相对表达量及蛋白浓度(4)驴皮伤口注射5-FU,可延长肉芽期伤口愈合的时间,但愈合后不形成瘢痕疙瘩,下调TGF-β/smad信号通路相关基因m RNA相对表达量及蛋白浓度。本试验为人类伤口愈合机制和无瘢痕疙瘩愈合的研究提供参考依据。