论文部分内容阅读
背景：结肠癌（coloncancer，CR）是世界第三大肿瘤，也是我国最常见的九大肿瘤之一。由于结肠癌的发病因素与社会环境、生活方式以及遗传背景等有关，所以在过去的20年中结肠癌患病人数持续增加，发病率不断升高。结肠癌还可以引起肠梗阻、肠穿孔等严重的并发症，即使经过常规放化疗、手术等治疗，但患者的5年无病生存率及晚期的生存质量并不理想。在早期手术后，及时治疗以控制疾病发展，晚期及时采用药物化疗减少复发及转移，可以提高结肠癌患者的生存率及晚期的生存质量。硼替佐米(Bortezomib)是首个应用于临床研究的蛋白酶体抑制剂。美国食品药物管理局(FDA)在2003年批准硼替佐米用于治疗进展期的多发性骨髓瘤患者。美国癌症研究所用60株来自人类不同肿瘤的细胞，对硼替佐米进行了药物试验，发现其能强效地抑制细胞的增殖能力。这些肿瘤包括多发性骨髓瘤、前列腺癌、胰腺癌、肾细胞癌和鳞状细胞癌。其作用机制的研究大多集中于核因子κB(NF-κB)途径。目前有文献报道，硼替佐米还可以通过PI3K/Akt途径对多发性骨髓瘤、胰腺癌和胃癌等癌症产生抗肿瘤作用。通过对PI3K/Akt途径的调控，可以有效的抑制肿瘤细胞的增殖和转移，诱导肿瘤细胞的凋亡。目前在结肠癌中尚没有硼替佐米通过对PI3K/Akt途径的调控来影响结肠癌细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移能力的相关报道。目的：1研究硼替佐米对结肠癌细胞系HT-29恶性生物学行为的影响；2探讨硼替佐米通过PTEN调控PI3K/Akt途径及下游信号分子，影响结肠癌细胞恶性生物学行为的机制。方法：1.硼替佐米1-500nmol/L处理结肠癌HT-29细胞24h及48h，MTT法检测细胞存活率及药物IC50值；2.流式细胞术检测经80nmol/L硼替佐米处理后HT-29细胞凋亡及周期的变化；3.细胞划痕实验及Transwell侵袭实验观察硼替佐米对HT-29细胞侵袭及迁移能力的影响；4.激光共聚焦观察E-cadherin在经硼替佐米处理后HT-29的亚细胞定位；5.Westernblot技术检测caspase-3,E-cadherin,p-Akt和PTEN蛋白表达水平变化；6.设计下调PTEN shRNA序列，包装慢病毒载体，感染HT-29细胞系。建立稳转细胞系，并用硼替佐米处理后，观察PTEN下调后，药物对细胞凋亡、侵袭及迁移能力的影响。结果：1.硼替佐米以时间依赖方式抑制结肠癌HT-29细胞的增殖能力，48小时IC50值是82.43nmol/L；2.细胞凋亡实验显示药物作用24小时后细胞开始出现凋亡，48小时凋亡明显。硼替佐米作用24小时后细胞周期明显阻滞在G0/G1期；3.细胞划痕实验及Transwell侵袭实验显示硼替佐米可以有效的降低HT-29细胞的侵袭及迁移能力；4.激光共聚焦试验显示：硼替佐米处理HT-29细胞后，E-cadherin出现膜浆转位现象；5.Western blot实验显示，80nmol/L硼替佐米处理结肠癌HT-29细胞后PTEN蛋白、E-cadherin蛋白表达水平随时间的延长明显增加，而p-Akt蛋白表达水平随时间的延长明显下降；6.慢病毒干扰抑制PTEN基因的表达后，用硼替佐米处理HT-29细胞，比较HT-29细胞与未加药物的HT-29细胞的凋亡、侵袭及迁移能力，结果显示无明显差异，但下调PTEN基因后HT-29细胞的侵袭及迁移能力与正常HT-29细胞相比明显增强。Westernblot实验显示，硼替佐米处理结肠癌HT-29细胞后PTEN、p-Akt蛋白表达水平无明显变化。结论：硼替佐米可以抑制结肠癌HT-29细胞增殖、诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡，降低细胞的侵袭及迁移能力。其机制可能是通过硼替佐米抑制PTEN蛋白降解，从而抑制PI3K/Akt途径。这一结果为结肠癌治疗提供了新的候选药物。