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目的 人类基因组计划(Human Genome Project，HGP)给我们展示了人类遗传学研究的广阔前景。包括肿瘤在内的疾病致病基因的克隆和定位是人类基因组计划的一项重要内容。我国正根据自己的遗传学发展状况和病源优势，紧紧围绕基因组计划，积极开展致病基因的克隆和定位工作。肿瘤的发生发展是一个多因素、多阶段、多途径及多基因变异的综合复杂病变过程，不同种类的肿瘤在不同的环境及不同的发展阶段，涉及的相关基因的种类也不同。因此，探讨不同类型肿瘤相关基因是认识肿瘤发生分子机制、开展基因诊断和基因治疗的基本前提。抑癌基因(tumor sppressor gene，TSG)失活理论和杂合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)概念表明了肿瘤抑制基因的杂合性缺失与肿瘤发生发展关系，并将缺失定位于染色体上。染色体常见LOH的区域往往是与肿瘤发生密切相关的抑癌基因存在的标记。通过这种策略已相继克隆出视网膜母细胞瘤基因Rb1、大肠癌易感基因APC和DCC、肾母细胞瘤WF1基因和乳腺癌易感基因BRCA1、BRCA2等。因此，通过LOH定位寻找TSG是肿瘤分子遗传学研究的热点之一。为了克隆到LOH位点中的一个或多个抑癌基因，研究者们正在缩小定位LOH发生的位点区域。如我国学者发现的肝癌17p13．3LOH定位于D17S5和D17S34位点之间，并在其中发现了有18个外显子，长2.0kb的新候选抑癌基因HCCSI。 胃癌(gastric carcer，GC)是消化道最常见的恶性肿瘤，占我国癌发病和死亡率之首。目前，已在多条染色体发现频繁LOH区域，涉及的相关抑癌基因和候选抑癌基因有p53、Smad4、p16、DCC等，还有相继发现的候选TSG遗传标记位点。可见，不断发现胃癌新的LOH位点，确定胃癌组织中染色体最常见缺失区域，逐步缩小缺失范围，定位克隆出胃癌相关新的抑癌基因，并探讨其生物学功能，具有重要意义。 本文在前期比较基因组杂交(comParative geno而c场而dization，CGH)研究基础上采用微卫星DNA多态标记对17、18号染色体进行基因组扫描，确定与胃癌发生相关的染色体区带，寻找胃癌相关的已知基因或未知基因，将胃癌发生相关基因定位在染色体最小范围内，为胃癌相关的肿瘤抑制基因定位、克隆提供线索。方法 45例原发性胃癌及癌旁正常组织来自哈尔滨医科大学附属第一、第二和第三临床医学院住院病人的手术样本，取材前患者均未接受放疗和化疗。并经过病理学检验证实其组织类型，取材后样本置于一80“C冻存。 1.基因组DNA提取 应用GIBCOL DNAzol提取试剂，提取肿瘤及相应的癌旁正常组织基因组DNA，用Pllarinaeia DNA/RNA ealeulator测定浓度及纯度。 2.第一批引物选择、标记、PCR反应体系 选取用FAM(蓝)、HEX(绿)、NED(黄)三种颜色荧光染料标记的29对引物(panel 23、panel 24，美国ABI公司产品)，其中包括覆盖一7号染色体的巧个位点(7个位点分布在17p，8个位点分布在17q，平均杂合度0.76，平均间距scM)，覆盖18号染色体的14个位点(5个位点分布在18p，9个位点分布在l8q，平均杂合度0.77，平均间距gcM)对45例原发性胃癌通过低密度微卫星位点扫描进行杂合性缺失分析。采用多重PCR方法，将4-巧对引物放在同一反应体系内，总反应体系5闪中包括:10 x PCR缓冲液0 .5林l，25mm(》FL MgC120.6林l，10 mm亦L dN，fP 5 0.1闪，Q solutionl闪，su/闪Hotstar TaqT”DNA Polymerase 0.04闪，引物0.04沙对，模板DN舫ongo 3.第二批引物选择、标记、PCR反应体系 在分析第一批引物得到的杂合性缺失结果基础之上，我们又分别选择了17号染色体3个重叠缺失区内36个微卫星位点(httP:刀tesesrch.marsh-fieldcliniC.。rs)，进一步通过高密度微卫星位点扫描进行杂合性缺失分析。用FAM(蓝)、。旺X(绿)二种颜色荧光染料末端标记引物(北京三博远志生物技术公司合成)，依据引物扩增片段大小及荧光染料颜色将其分组。采用多重PCR方.法，将3一5对引物放在同一反应体系内进行反应，总反应体系10闪中包括:10 x pCR缓冲液1闪，25mzn心L MgC12 1.2林l10 mmoFLdNTPs 0 .2闪，Q sotutionZ林l，SU/林l，引物0.08林F对，模板DNA50嗯。 4.LOH检测Hotstar介qTM DNA Polymerase 0.08林l 按Touchdo”-循环，94℃预变性12PCR反应条件在PE%oo热循环仪上进行扩增。二相分钟后，第一相循环即94℃30秒，63℃z分钟，72℃l分50秒，共巧个循环(退火温度每个循环降低0.5℃)。第二相循环即94℃30秒，56℃1分钟，72℃l分50秒，共24个循环，最后72℃延伸15分钟。取PCR产物0 .7闪加1闪上样液(含加样缓冲液，分子量内标，甲酞胺)95℃变性5分钟，上样于4.5%聚丙烯酞胺凝胶中，在ABI PRIsM 377DNA测序仪中电泳2.5小时，用Genescan 3.1和GenotyPer2.1软件对电泳结果扫描，进行基因分型。扫描结果显示每个微卫星标记位点上胃癌组织及相应非瘤胃组织呈单一波峰者为纯合子，有两个波峰者为杂合子。杂合子中胃癌组织2条等位基因波峰比值/非瘤胃组织相应2条等位基因波峰比值在0.67一1 .3之间为无LOH，<0.67或>1 .3?