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自然界中,病毒共感染现象普遍存在。共感染过程中,病毒复制、感染率、致病性、细胞表型、组织嗜性和宿主范围等病毒及细胞的生物学特性都会发生改变。禽白血病病毒J亚群（ALV-J）属于致瘤性反转录病毒,可引起被感染鸡的免疫抑制和肿瘤发生,主要诱发髓细胞瘤,目前尚未研制出有效的疫苗进行防控,主要是通过净化控制病毒的传播,但由于其独特的传播能力和致病性,给家禽业造成了严重的经济损失。马立克氏病病毒（MDV）属于高致瘤性疱疹病毒,同样引起被感染鸡的免疫抑制和肿瘤发生,主要诱发淋巴细胞瘤,疫苗接种一直是预防和控制马立克氏病（MD）的主要策略,但持续的病毒进化导致毒株毒力不断增强,给MDV现有的控制策略带来挑战,使得MDV依然是养禽业的威胁。虽然ALV-J的净化和MD疫苗的临床应用减轻了两种病毒感染带来的负担,但一方面由于ALV-J污染MD疫苗现象频出以及MDV的毒力在疫苗接种压力下不断进化并逐渐增强,使得在接种疫苗后的鸡群中,ALV-J和MDV强毒株共感染现象频繁出现;另一方面,感染ALV-J后损害了病鸡对MD疫苗的免疫反应,使得感染ALV-J后继发感染MDV概率加大,造成ALV-J与MDV共感染现象越来越普遍。ALV-J与MDV共感染存在明显的协同作用,导致病毒进化加快、致瘤性增强及肿瘤谱扩展,造成病鸡的死亡率增加,免疫抑制增强,免疫应答失败,继发感染频发,给这两种疾病的防控带来严峻挑战,严重影响家禽业的健康可持续发展。肿瘤的发展和形成是ALV-J与MDV造成病鸡死亡的重要因素,但其协同致瘤机制未明。本研究利用响应面法建立了 ALV-J与MDV的共感染模型,利用病理学、分子生物学和生物信息学技术验证了 ALV-J与MDV在体内外的协同复制和致瘤,筛选鉴定了其协同激活的宿主关键分子双皮质肾上腺素样激酶1（DCLK1）,揭示了 DCLK1通过激活Wnt/β-catenin信号通路诱导上皮-间质转化（EMT）,从而促进肿瘤发生,最终阐明了 ALV-J与MDV协同致瘤的分子机制。为明确ALV-J与MDV体内外的协同复制及致病性,首先建立了体外细胞共感染模型,通过电镜观察发现ALV-J与MDV可共感染同一细胞。以共感染时间、ALV-J TCID50、MDVPFU为自变量,以ALV-J与MDV病毒拷贝数为试验指标,构建了 ALV-J与MDV共感染的响应面模型（RSM）,直观的反映了在共感染过程中病毒拷贝数随自变量变化的趋势,确定了病毒协同复制效应最佳时间点为共感染后72 h;进一步通过qPCR和WB证实,在共感染细胞中,ALV-J与MDV协同促进了双方的复制,其中ALV-J的Gag蛋白促进MDV表达量增加1.29倍,效果最明显,Env蛋白促进MDV表达量增加1.15倍,证明ALV-J的结构蛋白对MDV的复制具有促进作用。感染细胞炎症因子的释放是肿瘤发生发展的基础条件。鉴于此,通过ELISA检测了与肿瘤发展相关的炎性因子IL-6、IL-10和TGF-β的动态表达,表明ALV-J与MDV协同促进了炎性因子分泌。为进一步明确ALV-J与MDV的协同致病性,建立了共感染动物模型,死亡率统计显示,共感染组鸡的死亡率为45%,显著高于MDV组20%和ALV-J组5%的死亡率;血像观察显示共感染组中淋巴细胞与单核细胞数量显著高于单感染组,证明两病毒协同加重了机体炎症反应;病理组织学观察发现共感染组鸡肝脏、肾脏和心脏中有明显的髓细胞瘤与淋巴细胞瘤混合肿瘤灶,而ALV-J和MDV单感染组仅有炎症反应;通过对各组鸡肝脏、脾脏和法氏囊的病毒载量分析发现,共感染组鸡各组织病毒载量明显高于单感染组鸡,证明ALV-J和MDV协同促进体内双方病毒复制。以上结果证明ALV-J与MDV具有协同复制及协同致瘤作用。EMT是肿瘤发生和转化的重要指征。为明确ALV-J与MDV对EMT的影响,检测了 ALV-J与MDV共感染细胞和组织中的EMT标志分子表达。体外试验,通过qPCR和WB证明ALV-J与MDV协同上调了 EMT间质标志物N-cadherin、Vimentin和转录因子Snail的表达,协同下调了上皮标志物E-cadherin在细胞中的表达和分布;体内试验,通过组织免疫荧光检测证明ALV-J与MDV协同下调了 E-cadherin在肝脏、脾脏、肾脏和十二指肠中的表达和分布。以上结果证明ALV-J与MDV协同促进EMT进程。为明确ALV-J与MDV协同激活EMT相关的宿主关键分子及信号通路,依据响应面模型优化条件,选取协同复制效应最佳的共感染后72 h的共感染细胞样品进行iTRAQ蛋白组学检测,单感染组和Mock组细胞作为对照,共发现15个表达差异显著的蛋白,通过功能分析筛选出与肿瘤相关、显著上调的DCLK1及Wnt诱导蛋白（WISP2）。为验证ALV-J与MDV协同激活DCLK1的表达,首先通过qPCR和WB检测DCLK1的表达,结果显示DCLK1在共感染组细胞中表达量显著上调;进一步通过IHC检测了 DCLK1在组织中的表达,结果显示ALV-J与MDV协同促进十二指肠肠隐窝中DCLK1的表达,确证了 ALV-J与MDV在体内外协同促进DCLK1的表达。过表达和敲低细胞DCLK1结果显示,DCLK1可显著促进ALV-J与MDV的复制和细胞增殖。为明确DCLK1对EMT进程的影响,在ALV-J与MDV共感染的细胞体系中过表达DCLK1,通过qPCR和WB检测EMT标志分子的表达,结果显示E-cadherin表达下调,N-cadherin、Vimentin和Snai1表达上调,说明DCLK1促进EMT的进程。以上结果证明ALV-J与MDV通过协同激活DCLK1促进EMT进程。为揭示介导DCLK1促进EMT的信号通路,检测了由WISP2激活的经典Wnt/β-catenin信号通路中标志蛋白的表达。结果表明ALV-J与MDV共感染增强了 Wnt和β-catenin在细胞中的蛋白表达,并促进β-catenin从细胞质向细胞核转移;体内研究表明ALV-J与MDV共感染促进了 β-catenin在肝脏、脾脏、肾脏和十二指肠中的表达。通过过表达DCLK1发现,DCLK1促进了 Wnt/β-catenin蛋白表达,而敲低DCLK1则抑制其蛋白表达,同时减弱了 β-catenin的核异位;通过Wnt/β-catenin通路激活剂CHIR-99021在细胞中进行挽救实验,结果表明CHIR-99021可以挽救由敲低DCLK1引起的β-catenin及其下游分子C-myc以及EMT标志物表达的变化;通过体内免疫荧光检测证明DCLK1与β-catenin存在荧光重叠,表明DCLK1与β-catenin通过相互作用促进了 β-catenin复合物的形成和下游靶基因C-myc的转录,从而诱导EMT进程。以上结果揭示了DCLK1通过靶向Wnt/β-catenin信号通路调节EMT进程。综上所述,本研究阐明了由简单逆转录病毒ALV-J和疱疹病毒MDV协同诱导肿瘤发生的分子机制。首先,通过体外、体内共感染模型,验证了 ALV-J与MDV协同促进双方的复制,并协同促进肿瘤发生;进一步,验证了 ALV-J与MDV可体内外协同激活EMT进程,随后,通过蛋白组学筛选出介导ALV-J与MDV协同激活EMT的宿主关键分子DCLK1,DCLK1通过Wnt/β-catenin信号通路激活了 EMT进程,从而协同促进肿瘤形成。本研究为高效联合防控两种病毒奠定理论基础及技术支撑,同时为逆转录病毒和疱疹病毒的协同致瘤机制研究提供借鉴。