目的　　利用 Ad-HMGB1-shRNA 体外下调巨噬细胞内高迁移率族蛋白 B1 （ High Mobility Group Box 1，HMGB1），观察HMGB1作为DNA分子伴侣，参与并调控巨噬细胞极化的过程，初步研究其潜在的分子机制，通过构建实验性自身免疫性心肌炎（ Experimental autoimmune myocarditis, EAM ）小鼠模型，阐明胞内HMGB1在EAM发生、发展进程中，对浸润心肌组织的巨噬细胞极化的调控机制。　　方法　　（1）筛选干扰片段：设计三条干扰序列，构建并包装重组腺病毒，体外培养小鼠巨噬细胞 RAW264.7 ，于对数期时进行转染，通过实时荧光定量 PCR （quantitative real-time PCR， qRT-PCR）和蛋白质印迹法（Western Blot）检测三组重组腺病毒的转染效率。　　（2）胞内HMGB1对巨噬细胞极化及抗原加工提呈能力的影响：进行成功转染后，利用Western Blot检测LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞和小鼠骨髓来源巨噬细胞中一氧化氮合酶（ iNOS ）蛋白水平；酶联免疫吸附法（ Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定细胞培养上清炎症介质分泌量；于体外单染CD86和MHCⅡ分子后，用流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）检测巨噬细胞抗原加工提呈能力。　　（3）胞内HMGB1对血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ，ANG II）诱导的巨噬细胞极化的影响：Ad-HMGB1-shRNA成功下调胞内HMGB1，ANG II体外作用12h，利用Western Blot检测各组细胞中iNOS蛋白表达水平；FCM检测抗原加工提呈的变化；ELISA测定细胞上清液中M1型相关因子的分泌情况。　　（4）胞内HMGB1影响巨噬细胞极化的分子机制：成功下调胞内HMGB1后再给予ANG II刺激细胞30 min，利用Western Blot检测核转录因子KappaB(nuclear transcription factor KappaB，NF-κB）、蛋白激酶ERK1/2、P38的磷酸化水平。　　（5）重组AAV感染EAM小鼠模型的构建：将3周龄的雄性BALB/c小鼠分为Control组（野生组）、EAM+AAV-HMGB1组（实验组）、EAM+AAV-Ns组（阳性对照组），小鼠尾静脉注射病毒悬液，每10天注射一次，共计两次。利用制备的抗原肽免疫小鼠，建立 EAM 模型。41 天后建模结束，取出小鼠骨髓来源巨噬细胞，倒置荧光显微镜观察荧光表达情况，确定感染效率。　　（6）AAV-HMGB1对EAM小鼠心肌组织炎症的治疗：将取出的心脏送往医院病理科，将进行心肌组织切片后，进行HE染色和病理评分；ELISA测定血清中炎症因子分泌变化；免疫荧光检测EAM小鼠心肌组织中F4/80+CD86+巨噬细胞浸润的情况。　　结果　　（1）重组腺病毒可明显下调巨噬细胞HMGB1蛋白水平以及mRNA水平，转染效率达90%以上。　　（2）Western Blot结果显示：成功下调胞内HMGB1后，实验组iNOS蛋白表达量明显少于对照组。ELISA 显示实验组炎症因子分泌减少，且与对照组相比有统计学差异（P<0.05）。通过FCM检测发现，实验组巨噬细胞抗原加工提呈能力亦受到抑制。　　（3）Western Blot、ELISA和FCM检测结果显示：下调胞内HMGB1后可减少iNOS、炎性介质以及CD86、MHCⅡ分子的表达，即可有效逆转ANG II所诱导的巨噬细胞向M1型极化。　　（4）预先成功下调巨噬细胞内HMGB1后，再以ANG II进行作用，与对照组相比，NF-κB、ERK1/2、P38分子磷酸化水平均呈现下降趋势，实验重复三次，均有统计学意义。　　（5）成功构建重组AAV感染的EAM小鼠模型。　　（6）AAV-HMGB1进行治疗后，EAM小鼠心肌组织病理评分、血清中炎性因子分泌、F4/80+CD86+M1型巨噬细胞浸润均显著低于对照组。　　结论　　（1）体外运用Ad-HMGB1-shRNA下调巨噬细胞内HMGB1能有效逆转巨噬细胞向促炎的M1型极化，减少炎症介质分泌，此过程依赖于转录因子NF-κB、蛋白激酶ERK1/2、P38信号分子通路进行调控。　　（ 2 ） AAV-HMGB1 可显著减少实验性自身免疫性心肌炎小鼠心肌组织中F4/80+CD86+巨噬细胞浸润、降低血清中炎性因子含量，进而缓解心肌炎症的发展，对疾病起到一定治疗作用。