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线粒体膜通透性转换孔(membrane permeability transition pore,MPTP)在线粒体控制的程序性死亡过程中起着至关重要的作用,对线粒体乃至细胞影响巨大。线粒体磷酸盐载体(phosphate carrier,Pi C)作为MPTP的重要组成部分,被认为参与了MPTP的组成,但Pi C在线粒体通透性转换中所发挥的作用还不是很明确。一氧化氮(NO)是一种可以调节植物生理功能与代谢反应的生物活性小分子,它参与调节植物代谢和果实的成熟与衰老过程,并可调控线粒体功能,在植物体内具有不可替代的重要作用。目前对NO和线粒体之间作用的研究大多集中在NO与线粒体呼吸、线粒体蛋白氧化损伤等方面,对于采后果实细胞中线粒体MPTP开放的变化以及NO对线粒体MPTP开放的调控作用的研究鲜有报道。开展外源NO对Pi C蛋白和MPTP影响的研究,有助于明确Pi C蛋白在线粒体通透性转换过程中的作用,以及NO对线粒体MPTP开放的调控机理,对于明确MPTP开放机制,维持良好的果实品质,延长果实采后贮藏期具有重要的意义。从肥城桃果实中提取RNA,根据Gen Bank中已经公布的其他植物的Pi C的基因保守序列设计简并引物,通过降落PCR、RACE、巢氏PCR等方法,克隆得到肥城桃果实Pi C基因c DNA全长共1769 bp,开放阅读框共有1116个碱基,编码372个氨基酸,在Gen Bank中的登录号为KP122948。疏水性预测Pi C为疏水性蛋白;跨膜预测Pi C为跨膜蛋白。氨基酸序列对比发现桃果实Pi C蛋白与其他植物Pi C蛋白的氨基酸序列同源性较高;系统进化树显示,桃果实Pi C蛋白氨基酸序列与苹果、梅花的亲缘关系最近。将构建的表达质粒p ET-30a-Pi C导入大肠杆菌Transetta(DE3)进行诱导表达,蛋白质电泳显示在39 k Da处出现目的条带。使用镍柱对重组蛋白进行纯化,用梯度透析的方法将重组蛋白复性。荧光定量PCR结果表明,NO处理显著上调了贮藏期间Pi C基因的表达。NO与Pi C蛋白的荧光光谱显示,NO可与Pi C蛋白发生反应,生成1:1的复合物。SPR方法进一步证明NO可使Pi C蛋白发生巯基亚硝基化,且该修饰可逆。利用磷脂化合物人工构建了磷脂双分子层膜进行体外模拟MPTP功能,并对其组分进行了探究,发现当MO与DPPC比例为1:1,浓度0.1 mg·m L-1时效果最好。酵母菌双杂交实验证明Pi C蛋白可以与Cyp D蛋白发生相互作用。