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OVA66是本实验室应用重组Cdna表达文库血清学分析（SEREX）技术筛选人卵巢癌Cdna文库得到的一种新的肿瘤相关抗原。前期实验结果表明OVA66呈CT抗原的表达特点，主要表达于某些肿瘤细胞及睾丸组织中。OVA66基因高表达可促进肿瘤细胞的增殖，有利于细胞的侵袭和转移。本研究着重于两方面工作：OVA66蛋白的原核表达和抗OVA66单克隆抗体的制备和鉴定。
（1）表达和纯化OVA66融合蛋白。利用本实验室已构建的pcDNA3.1 -OVA66及含6×His的原核表达载体pET32b(+)，构建重组质粒pET32b-OVA66。诱导大肠杆菌BL21(DE3)表达融合蛋白OVA66，发现融合蛋白主要以包涵体形式存在，将包涵体变性处理，获得可溶性的融合蛋白，经Ni-TED亲和层析柱纯化，然后用透析方法将融合蛋白复性并鉴定，融合蛋白纯度可达90％。
（2）制备小鼠抗OVA66单克隆抗体并分析其生物学特性。以纯化获得的OVA66融合蛋白免疫BALB/c小鼠，利用聚乙二醇将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行融合。以pET32b空载体表达蛋白为对照检测杂交瘤细胞培养上清中抗OVA66抗体的分泌，筛选出两株稳定分泌抗OVA66抗体的细胞5F4和4G9。这两株细胞分泌的抗体亚型均为IgG1，轻链为κ型。5F4抗体的亲和力常数为2.96×1010L/mol，4G9抗体的亲和力常数为0.40×1010 L/mol。Western blot结果证实这两株杂交瘤细胞分泌的抗体针对OVA66蛋白的不同表位。应用细胞免疫荧光法、流式细胞术、Western blot和免疫组化技术检测了抗体的特性。
综上所述，本课题成功构建了重组载体pET32b－OVA66，纯化了OVA66融合蛋白，制备了两株小鼠抗OVA66单克隆抗体杂交瘤细胞，并分析抗体的免疫生物学特性，为进一步深入研究OVA66的生物学功能和临床应用奠定了基础。