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研究背景及目的:结直肠癌是位居肺癌和乳腺癌/前列腺癌之后严重危害人类健康的第三位常见恶性肿瘤,在我国结直肠癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势。结直肠肿瘤的化疗敏感度差,尤其是对晚期转移性结直肠癌采用传统放化疗的疗效并不理想,因此寻找不良反应小、特异性高的新方法是结直肠癌治疗的重要课题之一。近年来光动力疗法(Photodynamic Therapy,PDT)以其有效、安全、副作用小、可协同性、可重复性和相对成本低等优点脱颖而出,已成为世界肿瘤防治科学中最活跃的研究领域之一。第二代光敏剂二氢卟吩e6(Chlorin e6,Ce6)是叶绿素a降解衍生物之一,具有肿瘤组织选择性高及非肿瘤组织清除率高等优点;同时光毒性小,从而为Ce6介导的光动力疗法(Ce6-PDT)在临床治疗结直肠癌提供了条件。然而目前PDT抑制杀伤肿瘤细胞的作用机制尚未完全清楚,已有研究表明PDT可以诱导细胞内p38MAPK通路的激活,p38MAPK是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的重要一员,参与细胞的存活、分化和凋亡等过程。但p38MAPK在不同细胞中对PDT的应答有所不同,不同的PDT参数也会影响其在细胞中的作用。本研究目的在于了解Ce6介导的光动力作用于SW620细胞后其自噬和凋亡的应答及p38MAPK在SW620细胞凋亡及自噬中的作用。为结直肠癌的治疗提供重要的理论和实验基础。研究方法及结果:第一部分Ce6-PDT对SW620细胞生长抑制及诱导其凋亡和自噬的研究实验主要研究Ce6-PDT对SW620细胞存活的影响,通过形态学观察、生化分析和蛋白检测等鉴定细胞凋亡和自噬的典型特征。实验结果如下:①噻唑蓝(MTT)比色法检测不同Ce6浓度(0.5,1,2μg/ml)、光照强度(3,6,12J/cm2)对SW620细胞的存活率的影响,结果显示Ce6剂量和光照强度依赖性抑制SW620细胞生长,单纯Ce6和单纯光照几乎没有细胞毒作用。②选择固定PDT参数(3 J/cm2,0.5μg/mlCe6),MDC示踪自噬泡显示PDT处理后2h胞内出现阳性自噬泡,且数量随着时间延长而增加;Western Blotting检测LC3在PDT处理后0.5 h开始转化,8 h达到极显著;加入自噬抑制剂BafA1,PDT处理后LC3Ⅱ条带明显增多,即自噬潮增加,证明Ce6-PDT可诱导SW620细胞自噬发生。③PDT处理后,Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测SW620细胞凋亡率为15.75%;DAPI核染色显示染色质凝集;凋亡相关蛋白Caspase-3活化水平也明显提高,随时间延长剪切片段增多持续到处理后24 h。实验结果表明Ce6-PDT诱导SW620细胞凋亡及自噬的发生。第二部分活性氧是Ce6-PDT诱导细胞凋亡及自噬的主要机制实验主要研究了 3 J/cm2的光照强度结合0.5 μg/ml的Ce6处理后,活性氧对SW620细胞损伤的影响。结果显示:①PDT处理后,DCFH-DA检测细胞生成大量活性氧,而活性氧清除剂NAC/单线态氧抑制剂His能有效降低PDT后活性氧水平。②PDT处理前加入NAC(5 mM)/His(10 mM),荧光显微镜观察显示DAPI亮染和染色质凝集现象明显减弱;Caspase-3,PARP的活化明显降低。③活性氧清除剂NAC/单线态氧抑制剂His可以部分抑制LC3的转化及自噬泡的生成。④MTT检测加入NAC/His后细胞的存活率也明显上升。实验结果显示ROS的生成是PDT细胞毒作用的主要因素,且通过激活p38MAPK调节细胞下游应答。第三部分MAPK通路的激活实验研究了 PDT(3 J/cm2 + 0.5 μg/ml Ce6)处理后,Western blotting检测MAPK通路相关蛋白表达变化。实验结果显示:①与对照组相比,PDT处理后0h,处理组细胞的p38MAPK开始活化,磷酸化水平上升,1h表达量最高,随后表达下降;JNK磷酸化水平Oh后也开始上升,但表达量很低,2 h后恢复正常水平;磷酸化的ERK表达基本与对照组相当。②加入活性氧抑制剂NAC,PDT处理后p38MAPK活化明显下降;而PDT处理前加入p38MAPK抑制剂SB203580检测PDT处理后活性氧的生成量却变化不大。实验结果表明PDT处理后,细胞生成大量活性氧,并激活p38MAPK的表达。第四部分p38MAPK在PDT诱导SW620细胞自噬及凋亡中的作用实验从p38MAPK抑制剂和p38MAPK干扰两种途径,通过MDC染色检测细胞自噬,Annexin V-PE/7-AAD检测细胞凋亡,Western Blotting检测自噬及凋亡相关蛋白表达,克隆形成等实验检测PDT处理前抑制p38MAPK表达后对细胞的影响。实验结果如下:①采用抑制剂SB203580/siRNAp38MAPK抑制p38MAPK表达后,PDT处理后细胞MDC阳性绿色荧光明显增强,LC3转化增多;细胞凋亡率及Caspase-3和PARP的活化也增强。②加入自噬抑制剂BafAl/3-MA,Annexin V-PE/7-AAD检测细胞凋亡率明显上升,且克隆形成检测细胞增殖率也明显下降。实验结果表明抑制p38MAPK表达明显加强了 PDT处理后细胞的自噬及凋亡,且自噬的增强起到保护细胞的作用。结论:Ce6-PDT能够诱导SW620细胞凋亡和自噬的发生。PDT通过产生活性氧激活p38MAPK信号通路,而p38MAPK的活化一定程度上抑制了凋亡和自噬的发生,抑制p38MAPK表达后增强的自噬起到了保护细胞的作用。