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背景与目的旋毛虫病是一种遍及全世界的人畜共患寄生虫病,目前其感染宿主的机制尚不完全清楚,研究发现在寄生虫感染的宿主血液循环中可稳定地检测到宿主或寄生虫来源的miRNA,它们通过靶向调节宿主mRNA,从而参与宿主-寄生虫的相互调节,或成为有效的生物标志物。本研究应用高通量测序对旋毛虫感染小鼠血清中旋毛虫和小鼠来源的差异miRNA分别进行检测,运用生物信息学方法对差异miRNA进行功能分析,同时对不同感染时期血清中它们的表达水平进行检测,并对宿主血清中发现的旋毛虫miRNA应用于旋毛虫病诊断的临床价值进行分析,以期为揭示旋毛虫病的致病机制、寻找新型生物标志物及治疗靶标等提供新思路。材料方法1.旋毛虫感染血清中宿主差异miRNA的鉴定 将60只小鼠随机平分为感染组和对照组,感染组小鼠经口灌胃旋毛虫肌幼虫500条/只,对照组小鼠经口灌胃生理盐水,于感染后30 d摘眼球取血清,提取总RNA,用于高通量测序及qRT-PCR验证。对高通量测序结果进行分析寻找旋毛虫感染血清中差异的小鼠miRNA,对其进行GO功能及KEGG信号通路分析。另将540只小鼠随机平分为感染组及对照组,在感染后12、18及30 d收集小鼠血清,应用qRT-PCR对不同感染时期血清中差异的小鼠miRNA表达水平进行检测。2.宿主感染血清中旋毛虫来源miRNA的鉴定及诊断价值 实验分组及血清样本采集、总RNA的提取同上,采用高通量测序对小鼠血清中旋毛虫来源的miRNA进行鉴定,应用生物信息学方法对鉴定的旋毛虫miRNA(let-7、miR-9、miR-1、miR-7-5p)进行功能分析,对感染12、18、30 d小鼠血清中它们的表达水平进行qRT-PCR检测,绘制ROC曲线分析其对旋毛虫病的诊断价值。qRT-PCR分析感染6、8、10、12 d小鼠血清中旋毛虫miR-9和miR-1的表达变化,并绘制ROC曲线,分析它们对旋毛虫病早期感染的诊断价值。最后,对旋毛虫及其他寄生虫(并殖吸虫、裂头蚴、囊尾蚴、日本血吸虫、棘球蚴)感染的人血清中这四种miRNA的表达水平进行检测,绘制ROC曲线,明确其对旋毛虫病的特异性诊断价值。结果1.在旋毛虫感染小鼠血清中10个小鼠miRNA发生差异表达,其中5个明显上调(miR-467a-3p、miR-467d-3p、miR-376b-3p、miR-664-3p 和 miR-292a-5p),5 个明显下调(miR-199a-5p、miR-455-5p、miR-125b-5p、miR-125a-5p 和miR-615-3p)。GO功能及KEGG通路分析显示,它们具有调节蛋白质磷酸化、细胞粘附等功能,参与粘着斑、MAPK等信号通路。qRT-PCR分析显示,在5个表达上调的小鼠miRNA中,miR-467a-3p和miR-467d-3p的表达水平从感染12 d到30 d逐渐增高;miR-376b-3p和miR-664-3p的表达水平在感染18 d时最高,随后逐渐降低。miR-292a-5p的表达水平从感染12 d到30d逐渐降低。在5个下调的miRNA中,除miR-199a-5p在感染30 d时显著下调外,其余4个miRNA(miR-455-5p、miR-125b-5p、miR-125a-5p 和 miR-615-3p)的表达在感染的不同时间均显著下调。2.高通量测序分析显示,在小鼠感染血清中共发现4个旋毛虫miRNA(let-7、miR-9、miR-1和miR-7-5p)。GO功能及KEGG通路分析显示,它们具有激酶活性、细胞间粘附等功能,主要参与Ras1、PI3K-Akt和MAPK等信号通路。qRT-PCR分析显示,小鼠血清中旋毛虫let-7的表达水平从感染12 d到30 d逐渐增高;miR-9的表达水平从感染12 d到30 d逐渐下降;miR-7-5p的表达水平在感染18 d时最高,然后逐渐降低;而miR-1的表达在不同感染时间均显著增高。3.宿主血清中旋毛虫来源的miR-7、miR-9、miR-1和let-7对人旋毛虫病均具有诊断价值(P<0.001),且四者联合诊断可提高诊断效能,可用于旋毛虫病与其他几种寄生虫病的鉴别诊断。miR-9在旋毛虫感染小鼠早期血清中表达增高,其对旋毛虫早期感染具有诊断价值(P<0.001)。结论1.旋毛虫感染的小鼠血清中共10个小鼠miRNA发生差异表达,它们具有调节蛋白质磷酸化、细胞粘附等功能,参与粘着斑、MAPK信号通路,可能在宿主应对旋毛虫感染的免疫应答等中发挥作用。2.旋毛虫感染的小鼠血清中发现4个旋毛虫来源的miRNA:let-7、miR-9、miR-1及miR-7,具有激酶活性、细胞间粘附等功能,参与PI3K-Akt、Ras1等信号通路,其可能调控宿主的基因表达,从而实现寄生于宿主横纹肌的目的。3.宿主血清中旋毛虫来源的let-7、miR-9、miR-1及miR-7对旋毛虫病有特异性的诊断价值,且miR-9可作为旋毛虫早期感染的有效诊断指标。