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目的冠状动脉性心脏病(coronary artery disease,CAD)简称冠心病,是一种由于冠状动脉固定性(动脉粥样化硬化)或动力性(血管痉挛)狭窄或阻塞,发生冠状循环障碍,引起心肌氧供需之间失衡而导致心肌缺血缺氧或坏死的一种心脏病。冠心病是一种严重威胁人体健康的重大疾病,其发病率和死亡率正逐年上升。全球每年有1700万人死于冠心病,我国每年也大约有100万人死于各种冠心病,心血管疾病已成为第一大死因。CAD是个人遗传背景、行为方式和各种环境因素相互作用引起的复杂性遗传性疾病,随着分子生物学技术的迅速发展,及对冠心病基因突变和基因多态性研究的深入,遗传因素在冠心病的发生、发展中作用和机制逐步阐明,为冠心病的诊治开辟了一个新的领域。对CAD致病基因的研究一直是CAD研究的热点。流行病学调查显示,在导致冠心病发生的众多危险因素中,血脂水平异常是造成冠心病死亡率及催患率增加的主要因素。常染色体显性高胆固醇血症(ADH)是冠心病的风险因子,其公认的原因:一是低密度脂蛋白受体(LDL-R)基因的突变,二是LDL-R的配体蛋白-载脂蛋白B(apoB)的功能缺陷;涉及ADH的第三个基因则是2003年发现的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/西布曲明9a型(Proprotein convertase subtilisin/kexin type9,PCSK9)。PCSK9是一种独特的前蛋白转化酶,它有多种序列变异体,这些变异与多种生理及病理过程有关。PCSK9参与肝再生和神经分化,负调节低密度脂蛋白受体,并与脂质代谢、高胆固醇血症和动脉粥样硬化等生物过程有关。国外研究资料显示,PCSK9基因及其多态性与冠心病的发生、发展及其预后相关联。PCSK9基因突变可干扰PCSK9正常功能,不同的突变可导致血液中胆固醇水平完全相反的变化;功能降低型可降低血浆胆固醇,改善冠心病患者的病情,并且能增强他汀类降血脂药物对高胆固醇血症患者的治疗效果;而功能增强型则可以升高血浆胆固醇,加重冠心病患者的病情,并且能降低他汀类降血脂药物对高胆固醇血症患者的治疗效果。因此,冠心病患者PCSK9基因及其多态性的研究将有助于进一步阐明冠心病发生、发展机制,为冠心病的预防和个性化治疗提供新途径。本实验拟在群体水平上对广东汉族人PCSK9基因单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP)位点进行筛查;通过病例-对照研究,分析PCSK9基因SNP位点在CAD患者和健康人群中的分布特点,以及与血脂水平、冠心病发生、病变程度的相关性,为阐明CAD的遗传发病机理、患者危险性分层评估、为冠心病的预防和个性化治疗等提供实验依据;同时探讨应用多种方法分析PCSK9基因SNP位点的可行性。方法1.PCSK9基因多态性的初步筛查收集于2009～2011年在广州医学院第一附属医院和广东省人民医院住院,经冠脉造影确诊的冠心病患者血液标本52例,其中,男性34例,女性18例,平均年龄63.06±9.92;分别提取基因组DNA模板,采用PCR方法对4,7,8,9,12外显子及其侧翼基因序列进行扩增,通过综合分析正反向基因序列测定结果识别SNPs。2. PCSK9基因E670G位点多态性与冠心病的相关性研究采集2009～2011年在广州医学院第一附属医院和广东省人民医院住院,经冠脉造影确诊的CAD患者血液标本288例,其中,男性186,女性102,平均年龄63.06±9.92;健康人血液标本300例,其中,男性168,女性132,平均年龄64.34±15.35。分别提取基因组DNA模板,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法分析PCSK9基因E670G位点SNP,并用基因测序法验证结果。血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)浓度水平等相关检测指标采用酶法测定。3.应用双向等位基因特异性引物PCR快速检测PCSK9基因I474V多态性位点采集2009～2011年在广州医学院第一附属医院和广东省人民医院住院,经冠脉造影确诊的CAD患者血液标本288例,健康人血液标本300例;分别提取基因组DNA模板,应用双向等位基因特异性引物PCR(Bi- PASA PCR)技术检测PCSK9基因I474V多态性位点。根据Bi- PASA PCR技术原理,在PCSK9基因I474V突变位点设计一对特异性引物,使其3’端碱基与SNP位点碱基互补;并以两条内侧引物作为约束条件,分别设计两条外侧引物,用来扩增含有突变点的DNA片段,PCR反应后根据电泳图谱判断PCSK9基因型。4.应用基于适配器连接介导的等位基因特异性扩增法检测PCSK9基因的单核苷酸多态性采集2009～2011年在广州医学院第一附属医院和广东省人民医院住院,经冠脉造影确诊的CAD患者血液标本288例,健康人血液标本300例;分别提取基因组DNA模板,应用基于适配器连接介导的等位基因特异性扩增法(Adapter Ligation-mediated Allele-specific Amplification,ALM-ASA)技术,同时检测PCSK9基因中的3个SNP位点(F216L、D374Y和N425S)。首先设计3对引物在单管中预扩增含所待测SNP位点的三段片段,再通过酶切、酶连接和多重PCR特异性扩增等步骤检测判断SNP的类型。并用基因测序法验证ALM-ASA结果的可靠性。结果1. PCSK9基因多态性的初步筛查对52例冠心病患者的PCSK9基因外显子4、7、8、9和12基因序列进行PCR和基因测序筛查。测序区段共1900bp,包括929bp编码区以及971bp非编码区,共发现6个SNPs,其中,5个在编码区,1个在内含子区。检出的多态性位点等位基因频率在0.01-0.95之间。编码区分布密度为SNP1/186bp,非编码区分布密度为SNP1/971bp。位于编码区的5个SNPs中,F216L、D374Y、I474V和E670G为错义突变,V460V为同义突变。将所得结果与NCBI的SNPs进行比较,检出的6个SNPs在NCBI数据库中均有报道。其中F216L和D374Y多态性位点在国内未见相关报道,未检出国外研究报道的N425S、I424V和A443T等基因多态性位点。2. PCSK9基因E670G位点多态性与冠心病的相关性研究中国广东地区CAD患者和健康人群在E670G位点的等位基因频率、基因型频率分布差异无统计学意义(P>0.05)。CAD患者组和对照组之间TC、LDL-C、HDL-C水平差异具有统计学意义(P<0.05),TG水平差异无统计学意义(P>0.05)。CAD患者组中AA和AG基因型之间LDL-C、HDL-C的差异具有统计学意义(P<0.05), TC、TG的差异没有统计学意义(P>0.05);与非670G携带者比较,670G携带者血LDL-C水平增高,血HDL-C水平降低。AG基因型的冠脉病变支数明显高于AA基因型,其差异具有统计学意义(P<0.05)。3.应用双向等位基因特异性引物PCR快速检测PCSK9基因I474V多态性位点应用Bi-PASAPCR技术设计两对引物即可实现对PCSK9基因I474V多态性位点检测,简便易行、不受限制性内切酶位点和价格等条件限制,耗时短、结果易于判读。检测结果表明,中国广东地区CAD患者和健康人群在I474V位点的等位基因频率、基因型频率分布差异无统计学意义(P>0.05)。CAD患者组和对照组之间TC、LDL-C、HDL-C水平差异具有统计学意义(P<0.05),TG水平差异无统计学意义(P>0.05)。CAD患者组中II和IV基因型之间TC、TG的差异具有统计学意义(P<0.05), HDL-C、LDL-C的差异没有统计学意义(P>0.05);与非474V携带者比较,474V携带者血TC、TG水平增高。IV基型的冠脉病变支数明显高于II基因型,其差异具有统计学意义(P<0.05)。4.应用基于适配器连接介导的等位基因特异性扩增法检测PCSK9基因的单核苷酸多态性应用ALM-ASA法可同时对PCSK9基因多个SNP位点的检测。通过对中国广东地区CAD患者和健康人群的基因研究,尚未发现N425S多态性位点,F216L、D374Y位点的等位基因频率、基因型频率分布差异无统计学意义(P>0.05)。CAD患者组和对照组之间TC、LDL-C、HDL-C水平差异具有统计学意义(P<0.05)。CAD患者组中FF和FL基因型、DD与DY之间TC、TG、LDL-C、HDL-C水平的差异无统计学意义(P>0.05)。FF和FL基因型、DD与DY之间的冠脉病变支数差异无统计学意义(P>0.05)。结论1.通过对52例广东地区冠心病患者的PCSK9基因外显子4、7、8、9和12基因序列进行PCR和基因测序筛查,共发现6个SNPs,其中,5个在编码区,1个在内含子区。位于编码区的5个SNPs中,F216L、D374Y、I474V和E670G为错义突变,V460V为同义突变。将所得结果与NCBI的SNPs进行比较,这6个SNPs在NCBI数据库中均有报道。其中F216L和D374Y多态性位点在国内未见相关报道,未检出国外研究报道的N425S、I424V和A443T等基因多态性位点。2.通过对PCSK9基因E670G、I474V、F216L、N425S和D374Y多态性的研究表明,上述多态性位点的基因型频率和等位基因频率在中国广东汉族健康人群和冠心病患者之间的分布差异均无统计学意义(P<0.05);PCSK9基因E670G多态性与LDL-C升高,HDL-C降低相关联;I474V多态性与TC、TG水平升高相关联,这两种多态性位点同时与冠心病病变严重程度有一定关联。F216L、D374Y位点CAD患者组中FF和FL基因型、DD与DY基因型之间TC、TG、LDL-C、HDL-C水平及冠脉病变支数差异均无统计学意义(P>0.05)。3.应用Bi- PASA PCR技术设计两对引物即可实现对PCSK9基因I474V多态性位点检测,简便易行、耗时短、结果易于判读,且不受限制性内切酶位点和价格等条件限制。应用ALM-ASA法可同时对PCSK9基因的多个SNP位点的进行检测。