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目的: 利用转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1 TGF-β1)促进人眼Tenons囊成纤维细胞(Human Tenons capsulefibroblasts，HTCF)增殖和细胞胶原合成模拟青光眼术后瘢痕形成，观察HSP47 siRNA重组质粒对TGF-β1促进成纤维细胞增殖的影响以及转染后细胞胶原纤维合成的变化，探讨RNA干扰技术特异的沉默HSP47基因是否能成为对抗青光眼滤过手术后瘢痕形成的新手段。 方法: 1.人眼Tenons囊成纤维细胞的体外培养及鉴定:在青光眼滤过手术术中取病人的Tenons囊组织，采用组织块贴壁培养法进行人眼Tenons成纤维细胞的原代培养，当细胞生长至80-90％融合时，对其进行传代培养。进一步对细胞进行免疫细胞化学染色鉴定，予以波形蛋白(Vimentin)及角蛋白(Kevatin)的染色，鉴定所培养细胞是否为成纤维细胞。 2.HSP47siRNA表达载体的构建及鉴定:针对HSP47基因设计siRNA序列，克隆到空载体psiRNA-hH1-neo G2载体中，转化感受态细胞，挑选阳性克隆行PCR鉴定，扩增提取质粒，进一步行酶切鉴定和测序分析。 3.CCK8法检测HSP47 siRNA重组质粒对TGF-β1促进人眼Tenons囊成纤维细增殖活性的影响:试验分组为:①正常细胞组;②psiRNA-hH1-neoG2-HSP47目的质粒+TGF-β1(5ng/ml)组;③TGF-β1(5ng/ml)组;④空载体+TGF-β1(5ng/ml)组;⑤空白对照组:仅含培养基但无细胞组;在LipofectamineTM2000的介导下瞬时转染细胞，分别在细胞转染后24h、48h、72h进行CCK8细胞活性检测，检测不同作用时间psiRNA-hH1-neoG2-HSP47对TGF-β1促进细胞增殖的影响，对各组细胞在450nm吸光度处A值进行比较和统计分析，对各组的细胞增殖活性进行计算并绘制条形图。 4.苦味酸-天狼星红染色后检测细胞的胶原变化:将细胞接种于6孔板内，试验分组为:①正常细胞组;②psiRNA-hH1-neo G2-HSP47目的质粒+TGF-β1(5ng/ml)组;③TGF-β1(5ng/ml)组;④空载体+TGF-β1(5ng/ml)组;分组进行转染后在72h进行细胞固定，进一步行苦味酸-天狼星红染色，染色后在偏振光显微镜下观察转染前后细胞内Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的变化并照相，进一步软件分析测定转染前后及TGF-β1刺激细胞后细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白含量的变化，并行统计分析。 结果: 1.人眼Tenons囊成纤维细胞采用组织块贴壁培养法在体外培养，培养方法简单容易，细胞在体外生长仍然活跃，细胞传代培养后生物学性状与体内基本一致，对所培养的细胞行免疫细胞化学染色鉴定，Vimentin抗体为染色阳性（胞浆呈棕黄色颗粒），kevatin染色为阴性，结果说明体外培养的细胞为成纤维细胞。 2.体外构建HSP47-siRNA即psiRNA-hH1-neo G2-HSP47后，行双酶切鉴定得到大小为2500kb的载体片段和500bp左右的目的片段;测序分析结果与设计序列相一致，证明重组质粒构建成功。 3.CCK8法检测示HSP47 siRNA重组质粒瞬时转染同时受TGF-β1刺激的人眼Tenons囊成纤维细胞后，TGF-β1对细胞增殖的促进作用会受一定的影响，细胞的增殖活性会下降。成纤维细胞经psiRNA-hH1-neo G2-HSP47的转染和TGF-β1(5ng/ml)的刺激在24h后细胞的A值及细胞增殖活性就开始出现差异，除空载体+TGF-β1(5ng/ml)组和TGF-β1(5ng/ml)组的细胞A值比较在24h、48h、72h差异均无统计学意义(P＞0.05)，其余各组在同一时间段的细胞A值对比差异均具有统计学意义(P＜0.05)，且psiRNA-hH1-neo G2-HSP47目的质粒+TGF-β1(5ng/ml)组3个时间点的细胞A值均低于正常细胞组，与TGF-β1(5ng/ml)组相比差异更具有高度统计学意义(P＜0.01);各组组内与24h对比结果显示psiRNA-hH1-neoG2-HSP47目的质粒与TGF-β1作用48h及72h对人眼Tenons囊成纤维细胞的增殖影响更显著，差异有统计学意义(P＜0.05)。 4.苦味酸-天狼星红染色法对各组细胞染色后，偏振光显微镜下见经TGF-β1诱导后即TGF-β1(5ng/ml)组的细胞中Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白密度明显增高，镜下胶原纤维的排列变密集且各色折光均明显增强，与正常细胞组及psiRNA-hH1-neo G2-HSP47目的质粒+TGF-β1(5ng/ml)组相比均有差异，且差异具有统计学意义(P＜0.05); psiRNA-hH1-neo G2-HSP47重组质粒转染后细胞中Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白含量均明显下降，纤维排列疏松，折光减弱，与空载体+TGF-β1(5ng/ml)组、TGF-β1(5ng/ml)组的差异具有高度统计学意义(P＜0.01);空载体+TGF-β1(5ng/ml)组与TGF-β1(5ng/ml)组相比较差异无统计学意义(P＞0.05)。 结论: 1.人眼Tenons囊成纤维细胞在体外培养方法容易，在体外增殖活跃，传代后细胞生长迅速，生物性状稳定，可作为目前青光眼滤过手术后局部纤维化研究的理想载体。 2.利用TGF-β1能有效促进人眼Tenons囊成纤维细胞增殖以及细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白合成增加，可模拟青光眼滤过手术后瘢痕形成时局部纤维化机制，为进一步动物试验提供依据。 3.利用化学合成的siRNA与psiRNA-hH1-neo G2载体连接，成功的构建了靶向HSP47基因的重组质粒，方法相对容易，可采用此方法将RNA干扰技术更好的用于临床治疗。 4.HSP47-siRNA能有效地抑制TGF-β1促进的人Tenons囊成纤维细胞增殖，转染后可使细胞的Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白合成减少，说明HSP47与TGF-β1在表达上具有同步性，利用RNA干扰技术影响HSP47基因的表达，同时也能影响TGF-β1的促纤维化作用，为进一步将RNA干扰技术应用于青光眼滤过术后抗纤维化提供了理论基础。