【摘 要】
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目的:探究基于蛋白水解靶向嵌合体技术（PROTAC）自主合成的新型PARP1降解剂NN3对乳腺癌细胞PARP1蛋白的降解功能及抗肿瘤作用,并研究其与HSP90C端抑制剂新生霉素（Novobiocin,NB）协同杀伤乳腺癌细胞的作用及机制。方法:（1）通过Western Blotting检测NN3给药后乳腺癌细胞中PARP1蛋白的降解情况;利用E3泛素连接酶MDM2配体Nutlin-3和PARP1蛋
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目的:探究基于蛋白水解靶向嵌合体技术（PROTAC）自主合成的新型PARP1降解剂NN3对乳腺癌细胞PARP1蛋白的降解功能及抗肿瘤作用,并研究其与HSP90C端抑制剂新生霉素（Novobiocin,NB）协同杀伤乳腺癌细胞的作用及机制。方法:（1）通过Western Blotting检测NN3给药后乳腺癌细胞中PARP1蛋白的降解情况;利用E3泛素连接酶MDM2配体Nutlin-3和PARP1蛋白配体Niraparib进行竞争结合实验,并用E1泛素活化酶抑制剂MLN4924和蛋白酶体抑制剂MG132抑制泛素-蛋白酶体途径,探究NN3对PARP1蛋白的降解是否基于PROTAC原理。接着,MTT和集落形成实验评估NN3对乳腺癌细胞杀伤作用,并通过Annexin V和7-AAD染色,流式细胞仪分析其对乳腺癌细胞凋亡的诱导作用。再者,用柔红霉素（Daunorubicin,DNR）对细胞进行损伤造模,流式细胞术检测NN3是否能抑制乳腺癌细胞的DNA修复。（2）Western Blotting检测NB对HSP90蛋白及其辅伴侣蛋白HSP70、p60hop、HSP27、P23等的影响,并检测客户蛋白BRCA1的表达是否受到抑制;柔红霉素预处理后,流式细胞术检测NB是否能抑制乳腺癌细胞的DNA修复。（3）MTT检测NN3和NB联合用药对乳腺癌细胞的杀伤是否存在协同作用,流式细胞术检测NN3和NB联用对乳腺癌细胞凋亡的诱导作用,且两者联用是否能协同抑制乳腺癌细胞的DNA修复。（4）药代动力学实验评估NN3在动物体内的吸收分布代谢排泄情况,并构建同种移植瘤模型检测NN3在小鼠体内的抗肿瘤作用。结果:（1）降解剂NN3明显降解乳腺癌细胞的PARP1蛋白,竞争结合实验表明是NN3是通过泛素-蛋白酶体途径降解PARP1,符合PROTAC技术原理;MTT和集落形成实验显示NN3对乳腺癌细胞有明显的杀伤作用;流式细胞术结果显示NN3可以显著诱导乳腺癌细胞的凋亡,抑制乳腺癌细胞DNA修复。（2）NB对HSP90蛋白及其辅伴侣蛋白HSP70、p60hop、HSP27、P23的表达并无显著影响,但抑制其客户蛋白BRCA1的表达;流式细胞术显示NB作用后乳腺癌细胞DNA双链断裂标志γ-H2AX的比例明显上调,DNA修复受到抑制（3）MTT结果显示NN3和NB联用对乳腺癌细胞的杀伤有明显的协同作用（7）流式细胞术表明NN3和NB联用增强对乳腺癌细胞凋亡的诱导,并显著抑制乳腺癌细胞DNA修复。（4）NN3在动物体内有良好的药代动力学特性,并且在较高剂量下能够抑制小鼠体内肿瘤的生长。结论:基于PROTAC原理的新型PARP1降解剂NN3能够有效降解肿瘤细胞的PARP1蛋白,进而阻断BER修复通路,并且对肿瘤细胞有一定的杀伤作用;而HSP90 C端抑制剂NB能够通过影响HSP90的分子伴侣功能抑制其客户蛋白BRCA1的表达,进而阻断由BRCA1介导的HR修复通路,两者联用同时抑制BER和HR修复通路,形成“合成致死”,导致肿瘤细胞DNA断裂得不到修复,诱导肿瘤细胞凋亡。
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