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前言:胃癌是消化道系统常见的恶性肿瘤之一,其在我国恶性肿瘤发病率中位居第2位,死亡率位居第3位,且新发病例中超过90%为中晚期胃癌。尽管近些年胃癌手术及药物治疗的效果有了很大的提升,但胃癌极易发生转移,且晚期胃癌患者预后较差。胃癌患者的5年生存率普遍较低,2010-2014年我国胃癌患者5年生存率仅为35.9%,较2000-2004年的30.2%并没有明显的改善,这严重地危害着胃癌患者的生命健康。因此,探索新的早期胃癌诊断生物标志物,对胃癌的治疗和判断预后具有重要意义。大量研究表明,microRNA（mi RNA）在多种恶性肿瘤的发生发展中发挥重要的调控作用。miRNA是一类由内源基因编码、约20-24个核苷酸长度的非编码单链RNA,通过与下游靶基因的3’非编码区（3’-untranslated region,3’-UTR）序列特异性的互补配对结合,在转录后水平抑制靶基因翻译、降低其表达水平,在炎症性疾病、免疫性疾病、结缔组织疾病及恶性肿瘤等多种疾病中发挥重要作用。此外,miRNA在多种肿瘤细胞中发挥类似癌基因或抑癌基因的作用,参与肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移等多种生物学行为的调控过程。MicroRNA-665（miR-665）是由位于人类染色体14q32.2的含72个脱氧核糖核苷酸序列编码、加工后生成的小分子RNA。目前发现miR-665在神经母细胞瘤、食管癌、肺癌、肝癌、妇科肿瘤、前列腺癌等多种类型肿瘤中调控肿瘤细胞增殖、分化、凋亡、侵袭、迁移及化疗耐药等多种生物学行为,但是在胃癌中的调控机制尚不清楚。目的:本研究旨在探讨人胃癌组织和胃癌细胞系中miR-665的表达水平,以及其表达水平与胃癌的生物学行为和相关临床病理特征的关系。检测miR-665对胃癌细胞生物学功能的影响,鉴定其潜在的调控靶基因,并探讨miR-665对靶基因CRIM1的表达调控以及对上皮-间质转化的影响。为miR-665在胃癌发生发展中的分子调节机制以及胃癌精准治疗提供新的靶点和依据。方法:1.从GEO（Gene Expression Omnibus）数据库中获得GSE93415数据集,并分析差异表达miRNA;2.利用实时定量PCR（RT-qPCR）技术检测胃癌细胞（MGC-803,MKN-45,HGC-27和AGS）及正常胃黏膜上皮细胞（GES-1）中mi RNA-665的表达量,同时检测63对胃癌组织及配对正常胃黏膜上皮组织（距肿瘤边缘3cm以上）中miRNA-665的表达量并分析其表达差异与临床病理特征的关系;3.通过lipofectamine 3000（Invitrogen）转染试剂将mi RNA-665 mimics、miRNA-665 mimics NC、miRNA-665 inhibitor以及miRNA-665 inhibitor NC分别转染到MGC-803和HGC-27胃癌细胞株中;4.体外细胞功能实验部分,通过细胞CCK-8法及集落形成实验检测mi RNA-665对胃癌细胞增殖能力及集落形成能力的影响;利用细胞划痕愈合实验、Transwell细胞实验,确定转染miRNA-665后对胃癌细胞的侵袭、迁移能力的影响;使用Western blot方法检测转染miRNA-665对胃癌细胞EMT标志物（E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白和波形蛋白）的影响;5.使用在线生物预测网站对miRNA-665潜在靶基因进行预测,并通过双荧光素酶实验对miRNA-665与靶基因CRIM1结合位点进一步明确;6.通过细胞挽救实验,将pcDNA3.1-CRIM1载体转染到已上调miR-665的MGC-803和HGC-27胃癌细胞中,检测对转染后胃癌细胞的侵袭、迁移和EMT的影响。结果:1.以P<0.05、|log2FC|≥1为筛选截断值,在GSE93415数据集中一共有110个异常表达的miRNA被发现,其中19个miRNA显著下调和91个miRNA显著上调（P<0.05）;2.RT-qPCR结果表明,miR-665在4种胃癌细胞系中的表达水平显著低于正常胃黏膜上皮细胞系GES-1中的表达水平（P<0.05）;此外,miR-665在胃癌组织样本中的表达水平明显低于配对正常胃黏膜上皮组织样本中的水平（P<0.05）。胃癌患者组织样本中的miR-665表达水平越低,对应胃癌患者的分期越晚（P=0.007）,分化程度越差（P=0.029）,胃癌患者发生远处转移的几率越高（P=0.031）;3.利用瞬时转染技术,成功构建了miRNA-665过表达和miRNA-665低表达的胃癌细胞模型;4.CCK-8实验结果表明与相应的对照组相比,转染miR-665 mimics的HGC-27、MGC-803细胞OD值在48h、72h和96h后明显下降,而转染miR-665 inhibitor的细胞表现了完全相反的效果（P<0.05）;克隆形成实验结果与上述结果一致,过表达的miR-665能抑制胃癌细胞株HGC-27、MGC-803增殖,而抑制miR-665的表达则显示出相反的效果（P<0.05）;细胞划痕愈合实验结果显示,与阴性对照组相比,转染miR-665mimics组的细胞划痕愈合速度显著降低,而转染miR-665 inhibitor组的MGC-803和HGC-27细胞愈合速度明显高于阴性对照组（P<0.05）;Transwell实验结果显示转染miR-665 mimics的MGC-803和HGC-27细胞穿过Transwell小室底膜的细胞数较阴性对照组显著变少,而转染miR-665 inhibitor的胃癌细胞表现截然相反的结果（P<0.05）;Western blot结果表明,胃癌细胞中miR-665的表达水平上调后,上皮相关标记物蛋白E-钙粘蛋白的表达增强（P<0.05）;同时,间充质表型相关标记物蛋白N-钙粘蛋白和波形蛋白的表达减弱（P<0.05）。而胃癌细胞中miR-665的表达下调可抑制E-钙粘蛋白表达（P<0.05）,并促进N-钙粘蛋白和波形蛋白的表达（P<0.05）;5.通过在线生物信息数据库（mi RDB、TargetScan和miRWalk）预测结果显示CRIM1是miR-665的潜在靶基因。双荧光素酶报告基因实验结果表明,miR-665 mimics可有效地抑制CRIM1＿WT（野生型）组的荧光素酶活性（P<0.01）,而CRIM1＿Mut（突变型）组荧光素酶活性没有发生明显变化,说明miR-665的序列与CRIM1基因3’-UTR上的序列互补结合;6.RT-qPCR结果表明,CRIM1在4种胃癌细胞系中的表达水平均显著高于正常胃黏膜上皮细胞系GES-1（P<0.05）;此外CRIM1在63例胃癌组织样本中的表达水平明显高于配对正常胃黏膜上皮组织样本中的水平（P<0.05）;7.补救实验结果显示过表达CRIM1可以明显削弱miR-665对胃癌细胞MGC-803和HGC-27的侵袭、迁移和EMT的抑制作用（P<0.05）。结论:1.在GSE93415数据集中,miR-665表现为胃癌细胞潜在的肿瘤抑制因子;2.MiR-665在胃癌细胞和胃癌组织样本中表达水平均为显著下调,其表达水平与胃癌患者的分期、分化程度以及远处转移显著相关;3.MiR-665 mimics和miR-665 inhibitor可以成功转染至胃癌细胞中,转染后细胞中miR-665的表达水平显著升高或降低;4.MiR-665对胃癌细胞MGC-803和HGC-27的增殖、侵袭、迁移以及EMT进展具有明显的抑制作用;5.基因CRIM1以及CRIM1蛋白在胃癌细胞和胃癌组织中的表达水平均为显著上调;6.miR-665在HGC-27、MGC-803细胞中能够靶向CRIM1抑制胃细胞的侵袭、迁移和EMT。