目的:人巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）感染在全世界范围内普遍存在,育龄期妇女感染率可达到50%-80%,且具有种属特异性。HCMV感染根据临床征象可分为症状性感染和无症状性感染。新生儿感染HCMV可导致中枢神经系统发育异常、肝炎、间质性肺炎、先天性耳聋、血小板减少、胆道畸形等严重疾病。HCMV感染导致的中枢神经系统的损害更是尤为严重,主要表现包括多小脑回、脑裂、巨脑回/无脑回、脑积水及皮质裂发育不良,小脑发育不全也有报道,是新生儿发育迟缓、智力低下及感音神经性耳聋的主要病因,严重的影响了出生人口素质,给家庭和社会带来巨大的精神和经济负担。HCMV感染致神经发育异常的早期诊断及其对细胞因子的调节作用并不清楚,使得其感染致新生儿神经系统缺陷的临床干预也面临挑战。近年发展起来并应用的各种检测HCMV感染的实验室方法各有利弊,尿液HCMV-DNA阳性能早期预测HCMV感染,但单纯依靠尿液HCMV-DNA拷贝数不能区分症状性与无症状性感染,检测结果影响因素很多,因此需多次留尿检测。血清HCMV-IgM抗体阳性提示近期存在HCMV活动性感染,但其检测受到抗体自身代谢规律及检测方法等限制,不能完全满足临床需要。且新生儿免疫系统不完善,故临床诊断新生儿症状性HCMV感染不易明确。有研究表明,HCMV可在单核巨噬细胞内囊化,避免病毒降解和从细胞中清除,从而持续生存于单核巨噬细胞中。因此,检测单核巨噬细胞中HCMV-DNA拷贝数可能为新生儿的早期诊断提供新的方法。在HCMV感染导致新生儿脑部异常的患儿中,与血清和其它体液相比较,脑脊液（Cerebro-Spinal Fluid,CSF）中细胞因子的水平更能直接反映中枢神经系统免疫反应的状况。研究表明,中枢神经系统感染后脑脊液中细胞因子可发生改变,故迫切需要一种快速、有效的方法来检测CSF中细胞因子,来帮助判断病情、指导治疗及改善预后。因为CSF本身蛋白含量很低,且大多数为白蛋白和免疫球蛋白,传统方法很难进行分离纯化和鉴定。蛋白芯片是一种高通量的蛋白质免疫检测分析技术,是近年来继基因芯片后发展起来的一项新的技术手段,微型化、集成化、高通量、高灵敏度、操作简便等是其主要优点。蛋白芯片在检测肿瘤、内分泌疾病、感染性疾病、心血管系统等疾病相关目的蛋白或蛋白变化方面得到初步进展。本课题通过评估巨细胞病毒感染新生儿外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC）、尿HCMV-DNA定量检测及血清HCMV-IgM抗体检测三种实验室诊断方法的价值,分析检测结果与新生儿脑发育异常等临床症状之间的相关性;并应用蛋白芯片技术测定HCMV感染新生儿血清及脑脊液中细胞因子,分析HCMV感染对脑发育异常的新生儿神经系统相关细胞因子的影响,本研究有望为HCMV感染中枢神经系统损害程度、临床治疗效果及预后提供评判指标,为进一步阐明HCMV感染的中枢神经系统损伤致病机理提供理论基础。方法:1.实验材料标本来自中国医科大学附属盛京医院新生儿病房。HCMV-DNA定量检测试剂盒购于上海星耀公司,血清HCMV-IgM抗体检测试剂盒购于意大利SORIN公司。AAH-CUST-G芯片试剂盒、Human Matrix Metalloproteinase-3（MMP-3）ELISA试剂盒、Human Acrp30 ELISA试剂盒及Human IL-1αELISA试剂盒购于广州锐博奥公司。人淋巴细胞分离液、PCR反应试剂、细胞裂解液、双蒸馏水、塑料离心管（2-5m L,50mL）、摇床、塑料保鲜膜、铝箔纸、可调节多道移液器（1-25mL）、超净工作台、PCR定量扩增仪、稳压电泳仪、台式高速离心机、LIAISON^?XL全自动化学发光免疫分析仪、Philips Intera Achieva 1.5T及3.0T磁共振机、Philips Brilliance CT（128）、InnoScan 300Microarray Scanner荧光扫描仪、Thermo Scientific Wellwash Versa芯片洗板机。引物合成及测序由Invitrogen公司（Shanghai,China）完成。2.实验方法（1）标本收集及分离PBMC收集102例中国医科大学附属盛京医院新生儿科病房HCMV感染新生儿全血及尿液标本。Ficoll密度梯度离心法分离PBMC。利用荧光定量聚合酶链反应（Fluorescence Quantitative PCR,FQ-PCR）法测定PBMC及尿HCMV-DNA定量,应用化学发光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay,CLIA）法检测血清HCMV-IgM抗体。（2）资料整理收集整理上述102例HCMV感染新生儿的神经系统影像学等临床资料,对以上结果进行相关性分析。根据临床征象分为症状性HCMV感染组55例和无症状性HCMV感染组47例,分别符合症状性HCMV感染及无症状性HCMV感染诊断标准和排除标准。症状性HCMV感染诊断标准:根据中华医学会儿科学分会感染学组2012年4月制定的《儿童巨细胞病毒性疾病诊断和防治的建议》,经尿HCMV PCR或血清HCMV IgM抗体确诊的HCMV感染。同时具备下列一项或以上表现:宫内发育迟缓、肝脾肿大、血小板减少(血小板小于100×10¹²个/L)、皮肤皮疹、直接胆红素升高（直接胆红素大于34umol/L）、转氨酶升高（谷丙转氨酶大于40U/L）、间质性肺炎、中枢神经系统影像学异常（颅内钙化、脑室扩张、脑实质囊肿、脑回畸形等）。无症状性HCMV感染诊断标准:经尿HCMV PCR或血清HCMV IgM抗体确诊的HCMV感染。同时无任何症状性HCMV感染临床表现。排除标准:合并有缺氧缺血性脑病、胆红素脑病、颅内出血（2级以上）、低血糖脑病患儿;合并弓形体、风疹病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、肝炎病毒、梅毒感染患儿;有中枢神经系统其它病原感染患儿;先天染色体疾病患儿。（3）蛋白芯片法筛选差异表达细胞因子选取4例中国医科大学附属盛京医院新生儿科病房临床诊断为症状性HCMV感染的新生儿为HCMV感染组,选取4例无中枢神经系统感染性疾病的新生儿做为对照组,应用包含有29种中枢神经系统相关细胞因子的蛋白芯片,筛选HCMV感染组与对照组相比血清及脑脊液中差异表达细胞因子。HCMV感染组:符合症状性HCMV感染诊断标准及排除标准的新生儿为HCMV感染组,同时具备中枢神经系统影像学或临床异常表现,中枢神经系统影像学异常包括颅内钙化、脑室扩张、脑实质囊肿、脑回畸形等;中枢神经系统临床异常表现包括抽搐、生理反射减弱或肌张力改变等。对照组:无中枢神经系统感染性疾病且为非HCMV感染新生儿作为对照组。（4）ELISA法验证通过ELISA法对30例HCMV感染组、30例化脑组和30例对照组新生儿脑脊液进行检测,以进一步验证蛋白芯片结果。HCMV感染组和对照组的定义同（3）中所述。化脑组:选取诊断为化脓性脑膜炎的新生儿作为化脑组。（5）统计学分析HCMV感染新生儿临床资料统计分析方法:定量数据因多不满足正态性假设,采用中位数（第25-75百分位数）进行描述,组间比较采用Wilcoxon秩和检验。定性数据采用频数（构成比）进行描述,组间比较采用Pearson卡方检验或Fisher确切概率法。采用Spearman等级相关系数度量两定量指标相关的程度和方向。双侧P<0.05差异有统计学意义。二元logistic回归采用逐步回归分析的方法,分析各项指标与临床症状及头部影像学结果的关系。ROC曲线下面积评估模型拟合结果。采用AAH-CUST-G的数据分析软件对蛋白芯片数据进行分析;蛋白芯片结果图绘图方法是heatmap.2/ggplot函数,数据包gplots,来自R/bioconductor。ELISA检测结果绘图应用绘图软件sigma plot 12.0。数据分析应用统计学软件SPSS version 17.0。（6）本研究方案经过中国医科大学附属盛京医院伦理委员会批准。结果:1、标本收集及分离PBMC（1）完成收集整理102例HCMV感染新生儿一般资料及临床资料,其中55例为HCMV感染症状性新生儿,47例为HCMV感染非症状性新生儿。（2）成功分离102例HCMV感染新生儿PBMC。（3）PBMC及尿HCMV-DNA定量,血清HCMV-IgM抗体滴度测定结果显示:PBMC HCMV-DNA定量检测中位数是888.0,第25-75百分位数为0.0-10500.0,以PBMC HCMV-DNA定量检测大于10作为阴性和阳性的界值,PBMC HCMV-DNA定量阴性43例（42.16%）,阳性59例（57.84%）;血清HCMV-Ig M抗体滴度中位数是0,第25-75百分位数为0.00-29.95,以血清HCMV-IgM抗体滴度大于等于22作为阴性和阳性的界值,血清HCMV-Ig M抗体阴性65例（63.73%）,阳性37例（36.27%）;尿HCMV-DNA定量检测中位数是12600,第25-75百分位数为2517.5-183000.0,以尿HCMV-DNA定量大于等于1000作为阴性和阳性的界值,HCMV-DNA定量阴性13例（12.75%）,阳性89例（87.25%）。2、三种实验诊断方法比较分析（1）102例HCMV感染新生儿中,针对症状性HCMV感染新生儿,PBMC HCMV-DNA定量检测灵敏度（70.9%）高于血清HCMV-IgM抗体,特异度（57.45%）高于尿HCMV-DNA定量。PBMC HCMV-DNA定量检测与头影像学结果具有较好的一致性,有较高灵敏度（80.0%）和特异度（48.39%）。（2）102例HCMV感染新生儿中,PBMC阳性组同PBMC阴性组比较,头影像学结果异常率显著升高,胎龄更小,出生体重更低。HCMV-IgM抗体阳性组同阴性组比较,谷丙转氨酶及总胆红素值显著升高。谷丙转氨酶及脑干听觉诱发电位异常率更高。组间比较均P<0.05。3、蛋白芯片法筛选差异因子HCMV感染组新生儿与对照组相比,在29种神经因子的筛选中发现,在脑脊液标本中筛选出3种差异表达细胞因子:脂肪细胞补体相关蛋白（adipocyte compiement-reiated protein of 30 kD,Acrp30）、基质金属蛋白酶-3（matrix metallo protein-3,MMP-3）及白细胞介素-1α（IL-1α）。HCMV感染组新生儿与对照组相比,血清中未见差异细胞因子表达。4、ELISA法验证ELISA验证结果显示在30例HCMV感染脑发育异常新生儿脑脊液中Acrp30含量为（39.76±2.01pg/mL）,30例非HCMV感染且无中枢神经系统感染性疾病新生儿脑脊液中为（7.75±0.10pg/m L）及化脓性脑膜炎新生儿脑脊液中为（40.86±2.28pg/m L）。HCMV感染脑发育异常的新生儿脑脊液中Acrp30较无中枢神经系统感染新生儿含量显著升高（P<0.01）。MMP-3含量分别是HCMV感染脑发育异常新生儿（0.18±0.45ng/m L）,无中枢神经系统感染性疾病新生儿（1.40±2.13ng/m L）及化脓性脑膜炎新生儿（1.15±1.37ng/mL）。HCMV感染脑发育异常新生儿脑脊液中MMP-3含量较无中枢神经系统感染性疾病新生儿（P<0.01）及化脓性脑膜炎新生儿（P<0.01）均显著下降。IL-1α含量分别是HCMV感染脑发育异常新生儿（2.36±0.99pg/m L）,无中枢神经系统感染性疾病新生儿（2.91±0.78pg/m L）及化脓性脑膜炎新生儿（2.41±0.47pg/mL）。HCMV感染脑发育异常新生儿脑脊液中IL-1α含量较无中枢神经系统感染性疾病新生儿显著下降（P<0.05）。结论:1、对于症状性HCMV感染新生儿,PBMC HCMV-DNA定量检测同血清HCMV-IgM抗体检测相比具有较好的灵敏度,同尿HCMV-DNA定量检测相比具有较好特异度;2、对于脑发育异常HCMV感染新生儿,PBMC HCMV-DNA定量检测与头部影像学结果具有较好的一致性,PBMC阳性新生儿头影像学异常率显著升高,胎龄更小,出生体重更低。HCMV-IgM抗体阳性新生儿谷丙转氨酶及总胆红素值显著升高。谷丙转氨酶及脑干听觉诱发电位异常率更高。3、PBMC病毒载量与症状性HCMV感染的新生儿神经系统损伤有一定的相关性。4、HCMV感染脑发育异常的新生儿脑脊液蛋白芯片与非HCMV感染且无中枢神经系统感染性疾病的新生儿相比,有3个细胞因子表达有差异。5、ELISA方法鉴定了脑脊液中Acrp30、MMP-3及IL-1α3个差异表达细胞因子,与蛋白芯片筛选结果一致。