研究背景脑性瘫痪(简称脑瘫)是指主要由围生期因素导致新生儿脑损伤所遗留的运动损伤综合征,是导致儿童伤残的首要原因,目前已成为世界性的公共卫生难题。研究显示,宫内感染和缺氧缺血性脑损伤是脑瘫发生的两个主要致病因素,两者主要通过炎症反应机制介导脑损伤,导致脑瘫的发生。大量细胞因子在炎症反应过程中被激活并相互作用、相互影响,共同参与调节机体的病理生理过程,是不同致病因素导致脑损伤的共同路径。此外,炎症反应和早期的免疫反应可部分重叠,两者均可通过诱导细胞因子释放增加参与机体的炎症进程,由于早产儿免疫功能不成熟,常常存在神经系统(CNS)免疫功能的失调,包括Th细胞亚群失衡,以及Th相关细胞因子的分泌异常,导致CNS的炎性病变而引起脑损伤。因此,深入探讨炎症反应及其炎性细胞因子的变化在未成熟脑损伤机制的研究中具有重要意义。胎儿或新生儿期的炎症反应可以持续至儿童期,提示脑瘫的发生可能与外周或中枢神经系统内炎性细胞因子的持续作用有关,而细胞因子水平的变化受基因的调控,因此,研究炎性细胞因子基因多态性有助于揭示其与脑瘫易感性之间的关系。白细胞介素(Interleukin,IL)-6、IL-8、IL-10和IL-17A是具有广泛生物学活性的多肽类细胞因子,在机体炎症反应过程中发挥重要作用,与新生儿脑损伤及脑瘫关系密切,但是关于IL-6、IL-8、IL-10和IL-17A单核苷酸多态性(SNPs)在小儿脑瘫中的联合研究,目前尚未见报道。表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis,SE)是我们生活环境中广泛存在的一种细菌,在NICU有高感染率,与早产儿感染关系密切,是导致早产儿菌血症、晚发型败血症及血管内导管相关性感染的最常见致病菌。流行病学研究显示早产儿SE感染与脑损伤之间存在相关性,可能与早产儿大脑发育不成熟及免疫力低下有关。研究表明SE可部分通过Toll样受体-2(TLR2)介导炎症反应而引起早产儿脑损伤,但确切的反应机制目前仍不清楚。新生儿虽然免疫功能不成熟,但并非完全免疫缺陷,仍有一定的免疫应答能力。在未成熟脑缺氧缺血性脑损伤模型中已经发现T细胞(CD4+和CD8+)和B细胞出现在损伤部位,以及Th细胞亚群相关的细胞因子高表达,提示细胞免疫/炎症反应参与了缺氧缺血性脑损伤的发生发展过程。本研究将以早产脑损伤及其严重后遗症脑瘫为研究对象,通过临床研究以及动物模型的实验研究,从基因调控、感染及缺氧缺血引起的免疫失调等方面探索炎症反应在未成熟脑损伤发生发展中的作用,为脑瘫的预防、诊断和治疗提供理论基础。第一部分炎性细胞因子基因多态性与脑瘫的关联性研究目的采用大样本病例-对照研究,通过分析脑瘫患儿IL-6、IL-8、IL-10和IL-17A基因多态性及其相应蛋白表达水平,在中国汉族人群中探讨炎性细胞因子和脑瘫易感性之间的关系。方法本研究选择713例脑瘫患儿作为脑瘫组,同期随机选取753例体检儿童为正常对照组,两组年龄比较无统计学差异。分别选择1.IL-6基因的5个SNP位点(rs1800796,rs2069837,rs2066992,rs2069840和rs10242595);2.IL-8基因的4个SNP位点(rs4073、rs2227307、rs2227306和rs2227543);3.IL-10基因的5个SNP位点(rs3024490、rs1800896、rs1800872、rs3021094和rs1518110);4.IL-17A基因的5个SNP位点(rs3819025、rs3748067、rs2275913、rs8193036和rs3819024),共19个SNP位点,使用Massarray分型技术对两组的研究对象进行基因分型。从上述两组中选取85例脑瘫患儿及75例正常对照儿童,使用液相芯片技术Luminex检测外周血IL-6、IL-8、IL-10和IL-17水平。使用SHEsis在线软件进行基因数据分析,每个SNP的多重检验均使用SNPSp D在线系统进行校正。使用Student’s t检验、Mann-Whitney’s检验及单因素方差分析进行蛋白数据分析,以P<0.05作为差异有无统计学意义的检验水准。结果1.IL-6、IL-8和IL-10所有SNP位点的等位基因及基因型频率分布在脑瘫组和正常对照组中均没有显著性差异(P>0.05);而IL-17A的rs3819024位点的等位基因型及基因型频率分布存在显著性差异(P=0.009,SNPSp D校正后P=0.027;P=0.005,SNPSp D校正后P=0.015)。2.亚组分析显示:(1)IL-6 rs2069837位点的等位基因频率在男性脑瘫组与男性对照组之间存在显著性差异(P=0.009,SNPSp D校正后P=0.027);(2)IL-6 rs2069837位点的等位基因频率在男性痉挛型脑瘫组与男性对照组中的分布存在显著性差异(P=0.007,SNPSp D校正后P=0.021);(3)IL-6 rs1800796和rs2066992位点的基因型频率在男性脑瘫伴PVL组与男性对照组中的分布存在差异(P=0.014,SNPSp D校正后P=0.042;P=0.013,SNPSp D校正后P=0.039);(4)IL-10 rs3024490位点的等位基因和基因型频率在痉挛型四肢瘫组与对照组之间存在显著性差异(P=0.004,SNPSp D校正后P=0.012;P=0.005,SNPSp D校正后P=0.015);(5)IL-17A rs2275913的等位基因和基因型频率在痉挛型四肢瘫组与对照组之间存在显著性差异(P=0.002,SNPSp D校正后P=0.006;P=0.006,SNPSp D校正后P=0.018),而rs3819024位点与痉挛型四肢瘫存在强相关性(P=0.000,P=0.000)。3.外周血IL-6、IL-10和IL-17水平在脑瘫组中高于对照组(P均<0.05),且基因分型可影响IL-6和IL-10的蛋白合成,IL-8水平在两组中无统计学差异(P>0.05)。结论1.IL-6基因多态性与脑瘫的易感性相关,以与性别相关联的方式参与了脑瘫的发病过程,并与男性脑瘫患儿中PVL的形成有关。2.IL-6和IL-10的基因多态性可影响外周血IL-6及IL-10相应蛋白水平,参与脑瘫的发生发展,IL-10和IL-17A基因多态性与痉挛型四肢瘫相关。第二部分表皮葡萄球菌感染在未成熟脑损伤中的作用目的采用1日龄新生小鼠,通过颈外静脉注射表皮葡萄球菌(SE)建立炎症性脑损伤模型,探讨SE感染造成未成熟脑损伤的可能机制。方法采用1日龄C57BL/6J野生型(WT)和TLR2基因敲除(TLR2-/-)小鼠,通过颈外静脉注射活SE,建立SE感染模型,所有注射动物随机分为SE组和无菌生理盐水(Saline)对照组。不同时间点处死取外周血、脑脊液(CSF)、脑组织、肝脏及脾脏等组织匀浆后进行细菌培养并观察细菌菌落计数(CFUs);Luminex技术测定外周血和脑组织的细胞因子,观察外周和中枢炎症反应情况;基因芯片技术测定TLR信号通路相关基因,观察TLR信号基因的表达情况;取脑组织进行MAP-2和MBP免疫组化染色,评估脑损伤程度。结果1.小鼠体内的SE清除情况:(1)在WT小鼠中,外周血及器官组织的CFUs在SE注射后4小时最高,随着时间延长逐渐下降,在注射后48小时基本消失;(2)在TLR2-/-小鼠中,外周血及器官组织的CFUs在SE注射后的各时间点均高于WT小鼠,并延迟至注射后72小时才基本消失;(3)CSF于任何时间点均未检测出CFU。2.SE感染对小鼠外周及脑组织炎症因子的影响:(1)注射后6小时,WT和TLR2-/-小鼠各自外周血IL-6,CCL2,CXCL1和IL-12p40水平在SE组中均明显高于Saline对照组,且SE注射后,TLR2-/-小鼠外周血CCL2和IL-12p40水平显著高于WT小鼠;(2)注射后6小时,WT和TLR2-/-小鼠各自脑匀浆中仅CCL2水平在SE组明显高于Saline对照组,而其它细胞因子水平未见明显变化(P>0.05)。3.SE感染对体循环及神经系统白细胞(WBC)募集的影响:(1)注射后6小时,WT和TLR2-/-小鼠各自外周血及CSF的WBC计数在SE组均明显高于saline对照组;(2)注射后24小时,WT和TLR2-/-小鼠各自外周血及CSF的WBC计数均无显著性差异(P>0.05)。4.SE感染对大脑Caspase-3活性的影响:注射后6小时,SE组与Saline对照组比较,Caspase-3活性在WT小鼠中明显增强,而在TLR2-/-小鼠中未见明显变化(P>0.05)。5.SE感染对大脑TLR信号通路相关基因表达的影响:在WT小鼠中,注射后:(1)6小时,SE组和Saline对照组比较,TLR2、干扰素调节因子-1(IRF-1)和前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)的基因表达量选择性上调;(2)24小时,SE组和Saline对照组比较,IRF-1和NFκBiβ(核转录因子NFκB的抑制剂)的基因表达量选择性上调。6.SE感染对脑损伤程度的影响:(1)SE组和Saline对照组比较,14日龄小鼠的大脑白质及灰质体积在WT和TLR2-/-小鼠中均明显减低;(2)SE组和Saline对照组比较,14日龄小鼠的大脑小胶质细胞数量在WT和TLR2-/-小鼠之间无统计学差异(P>0.05)。结论1.SE感染可导致新生1日龄小鼠外周及脑组织炎症反应,在细菌未进入脑脊液的情况下可影响未成熟大脑的发育。2.SE感染在生命早期可能通过TLR2依赖途径参与早产儿脑损伤,但随着感染时间延长,非TLR2依赖的途径可能被激活,参与未成熟脑损伤的发生发展过程。第三部分缺氧缺血后免疫/炎症反应在未成熟脑损伤中的作用目的采用5日龄新生小鼠,建立缺氧缺血(HI)早产脑损伤模型,探索缺氧缺血后细胞免疫/炎症反应在未成熟脑损伤中的作用。方法采用5日龄野生型小鼠建立HI早产脑损伤模型:结扎左侧颈总动脉,并将小鼠置于10%的氧气分别持续缺氧50分钟、70分钟和80分钟,于不同时间点处死取脑组织固定,进行硫素/品红酸染色以及MAP-2和MBP免疫组化染色,评估小鼠脑损伤程度,根据脑损伤程度选择合适的缺氧持续时间,以更好地模拟早产儿脑损伤。选择合适的缺氧持续时间后,分别于不同时间点处死取脑组织,进行大脑TREM-2/DAP12、Iba-1和DAPI三重免疫荧光染色,观察TREM-2和DAP12阳性细胞在大脑中的分布情况;并使用RT-PCR技术检测脑组织CD4+T淋巴细胞亚群相关细胞因子的m RNA表达水平,观察HI后的免疫/炎症反应状态。结果1.HI对脑损伤程度的影响:(1)HI后3天,HI-50分钟组(即持续缺氧时间为50分钟)中仅3/12(25%)的小鼠出现肉眼可见脑损伤,表现为损伤侧大脑半球海马CA1至CA3区神经元丢失;HI-70分钟组中大部分小鼠13/14(93%)出现脑损伤,表现为损伤侧大脑半球海马区及白质局灶性损伤同时存在,并伴有少量局部皮质损伤;HI-80分钟组中有14/16(88%)的小鼠出现脑损伤,其中6/16(37.5%)的小鼠损伤侧大脑半球皮质、海马、白质及丘脑等部位出现更为广泛的梗死,三组小鼠对照侧大脑半球均未见明显损伤;(2)HI后7天,HI-50分钟小鼠损伤侧半脑的灰质体积比对照侧半脑明显减少(P<0.05),两侧半脑白质体积无明显统计学差异(P>0.05);HI-70分钟小鼠损伤侧半脑的灰质体积(P<0.001)及白质体积(P<0.05)均比对照侧半脑明显减少;(3)选用5日龄小鼠HI-70分钟模型用于之后的分析;2.HI对大脑TREM-2和DAP12表达的影响:(1)随着HI后24小时、3天和7天时间的延长,损伤侧半脑TREM-2的表达逐渐增加并于HI后24小时达到最高,且主要分布于脑实质内和血管壁;(2)损伤侧半脑DAP12的表达主要集中在皮层下白质损伤区域、海马、脑室周围及脑膜等部位,且DAP12和Iba-1双阳性细胞在HI后24小时主要分布在损伤侧半脑脑室周围,在HI后3天主要分布在损伤侧海马近血管处及脑膜部位。3.HI对大脑细胞免疫/炎症反应的影响:(1)大脑CD4+T淋巴细胞的分布:脑内CD4+T淋巴细胞的数量在HI后24小时和7天均比同龄正常对照小鼠升高,且大部分CD4+T淋巴细胞分布在血管内,仅少量位于脑实质内;(2)Th1相关:损伤侧半脑T-bet和IL-12a的m RNA水平在HI后6小时显著升高;(3)Th2相关:损伤侧半脑IL-4基因在HI后6小时和24小时明显下调,IL-13基因在HI后6小时明显上调;(4)Th17相关:损伤侧半脑IL-6基因在HI后6小时和24小时明显增加,IL-22基因在HI后6小时明显上调;(5)Treg相关:损伤侧半脑Foxp3基因在HI后6小时和24小时明显下调。结论1.5日龄新生小鼠HI缺氧时间为70分钟时,可较好地模拟早产儿脑损伤。2.HI可引发大脑以Th1/Th17-和Th2/Treg反应失衡为特点的免疫/炎症反应,而这种免疫失衡发生在生命早期,可能与固有免疫反应有关。