原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma HCC)是世界范围内常见的恶性肿瘤之一,每年发病人数超过500000人。在世界范围内男性HCC发病率在恶性肿瘤中排名第五,死亡率排名第二,而在女性中也分居第七的发病率和第六的死亡率[1],其中超过50%的HCC发生在中国。在肝癌高发区域,超过90%的原发性肝癌(primary liver cancer PLC)为肝细胞癌[3]。在中国HBV感染是肝癌的最常见病因[4]。除了慢性肝炎病毒感染和后续的肝硬化外,HCC的危险因素还包括年龄、男性、家族史、嗜酒史、非酒精性脂肪肝、自身免疫性肝炎、肥胖和黄曲霉素暴露等。但是这些因素仅能解释50%-85%的肝癌病例,仍有部分肝癌患者并不具备这些病因[5-6],而在西方国家非病毒性肝癌所占比例更高。近几年的病例对照研究[5-7-8]和队列研究[9-11]已经证实糖尿病可能作为HCC的一个潜在致病因素。但是在亚洲HCC患者中仍存在一些争议,Tung等人认为糖尿病不是HBV和HCV感染导致的HCC患者的危险因素[12],而2009年Valter Donadon等在意大利的病例对照研究则证实了2型糖尿病为HCC的独立危险因素,同时发现不同糖尿病治疗方式与HCC的关系,在胰岛素和磺脲类药物治疗的患者中OR值为2.99(95%CI：1.34-6.65,P=0.007)而在二甲双胍治疗的患者中OR为0.33(95%CI：0.1-0.7,P=0.006)[13],这种现象在后续的许多研究中也得以证实[14]。对于目前糖尿病是否为HBV或HCV感染导致肝癌的独立危险因素的目前尚未达成共识,而且多数流行病学研究都是在西方国家进行。我国是肝癌的高发病区,超过50%的HCC发生我国,而且最主要致病因素是HBV感染,这和西方国家的最主要致病因素不同[2],而有关中国人肝癌与糖尿病相关性的研究还少见报道。综上所述,中国人中,糖尿病与肝癌之间的关联性尚不清楚,为进一步探索糖尿病与肝癌的关联性,我们设计了本课题第一部分,针对首次诊断为HCC的患者进行资料收集和统计分析,探讨糖尿病与HCC发生及其一般临床特征的关系。有研究认为糖尿病可以作为HCC患者的不良预后因素之一[15-16]。但目前关于糖尿病和不同治疗手段的HCC的预后影响尚未达成共识,尤其是在HBV感染的HCC患者。早期的研究认为糖尿病不是HCC手术患者的预后影响因素[17]。但最近有研究认为糖尿病是HBV阳性的HCC患者的不良预后因素之一,但对HCV阳性的HCC患者没有影响[15-18]。但最近的一个荟萃分析发现,糖尿病不是HBV阳性的HCC患者的不良预后因素,而是HCV阳性的HCC患者的不良预后因素[19]。但上述的流行病学研究有一定的局限性,大多数研究都集中在HCC手术治疗的患者,而且具体对不同肝炎背景导致的肝癌或不同肝癌治疗手段后的预后的影响尚未达成共识。而肝癌发生发展具有隐匿性较强,进展快等特点使大多数患者在诊断时已处于晚期,已经丧失了手术机会,预后较差且治疗手段较为局限[20]。经皮股动脉穿刺肝动脉造影化疗栓塞术(Transarterial chemoembolization therapy TACE)是肝癌局部血管性介入治疗方法,同时也是肝癌患者的非手术治疗手段之一[20]。但目前国内外有关糖尿病对HCC患者TACE术后生存期影响的研究较少。基于此研究背景,我们在本课题第二部分选取了有HBV感染后肝硬化并行TACE抗肿瘤治疗的HCC患者为研究对象,进行临床资料的收集和统计分析,探讨糖尿病与HCC患者TACE术后肝功能变化及预后的关系。肝癌的发生发展以及转移过程是一个多基因、多因素参与的过程,近年来在这一过程中的信号转导机制、相关基因调控和蛋白过度表达或异常激活的研究很多。随着越来越多的流行病学研究证实糖尿病与HCC之间的密切联系,关于其相关机制的研究也越来越多。在这过程中非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic steatohepatitis NASH)[21]、反应性活性氧(reactivity of reactive oxygen ROS)累积[22]、胰岛素抵抗(insulin resistance IR)[23]和损伤导致的肝脏炎性修复可能起着决定性作用。而已有研究证实NF-κB和STAT3作为重要的转录因子可能控制了肿瘤信号转导的中心,在炎症和肿瘤发生发展中起着重要的作用[24-26]。最近有研究也证实NCOA5+/-引起雄性小鼠的糖耐量异常和自发性HCC的发生[27]。CD34作为新生血管内皮细胞的一个重要标志,其表达水平与肿瘤的浸润转移和预后有关[28]。我们在课题的第三部分初步研究NF-κBP65/STAT3通路、NCOA5和CD34在HCC患者中的表达情况,并探讨其与肝癌患者一般临床病理特征和糖尿病背景的关系。方法1.普通HCC患者与糖尿病HCC患者的一般临床特征的比较回顾性收集2003.1-2012.12在南方医科大学附属南方医院首次病理诊断或临床确定诊断为肝细胞癌患者资料,观察一般临床特征(性别、年龄、HBV感染、HCV感染、肝硬化背景、肿瘤大小、BCLC分期、门静脉癌栓、消化道出血和有无转移)。对所有HCC患者按照性别、年龄、HBV感染、HCV感染、肝硬化背景、肿瘤大小、肿瘤BCLC分期、是否合并有门静脉癌栓或并发消化道出血及是否有转移灶分层,采用Pearson卡方检验来检测糖尿病与HCC患者这些临床特征之间的关系。2.观察HBV感染和肝硬化背景下行TACE抗肿瘤治疗的HCC患者一般临床特征从2003.1-2012.12在南方医科大学附属南方医院首次明确诊断为肝细胞癌的所有患者中,选取伴有HBV感染和肝硬化,并仅行TACE治疗的HCC患者为研究对象。共有290例患者,观察其一般临床特征(年龄、性别、血清AFP水平、肿瘤大小和BCLC分期)。3.分析糖尿病对HBV感染后肝硬化的HCC患者TACE治疗前后肝功能的影响收集290例HCC患者TACE治疗前和治疗后的肝功能(包括血清ALB、TBIL、 ALT、AST水平、PT时间和Child-Pugh评分)资料,运用两独立样本t检验和卡方检验,比较糖尿病对肝功能各指标的影响。4.分析糖尿病与有HBV感染和肝硬化的HCC患者TACE治疗前后Child-Pugh评分等指标的相关性对290例患者TACE治疗前后Child-Pugh评分与患者的年龄、性别、血清AFP水平、肿瘤大小、BCLC分期和糖尿病背景进行Spearman相关分析,探讨糖尿病与TACE治疗前后肝功能变化的相关关系。5.糖尿病与有HBV感染和肝硬化的HCC患者TACE治疗预后的分析运用log-rank单因素生存分析研究患者年龄、性别、血清AFP水平、肿瘤大小、BCLC分期、糖尿病和治疗前后Child-Pugh评分等指标与肝癌患者总生存时间的关系,将单因素分析有统计学意义的因素纳入COX多因素分析,探讨糖尿病是否为有HBV感染后肝硬化的HCC患者TACE治疗的独立预后因素。6.检测HCC组织中NF-κBP65、pSTAT3/STAT3、NCOA5和CD34的表达采用免疫组织化学法检测64例肝癌组织和癌旁组织中NF-KBP65、 pSTAT3/STAT3、NCOA5和CD34蛋白的表达情况,运用Pearson卡方检验或Fisher’s确切概率法比较癌组织和癌旁组织表达情况。7.分析糖尿病HCC组织中NF-κBP65、pSTAT3/STAT3、NCOA5和CD34的表达运用Pearson卡方检验或Fisher’s确切概率法比较31例糖尿病肝癌组织和33例非糖尿病肝癌组织中NF-κBP65、pSTAT3/STAT3、NCOA5和CD34的蛋白表达。用Spearman相关分析研究糖尿病肝癌组织中NCOA5、NF-KBP65和PSTAT3蛋白表达的相关性。8.分析NF-κBP65、pSTAT3/STAT3和NCOA5的蛋白表达与肝癌患者临床病例特征和预后的关系。采用Pearson卡方检验或Fisher’s确切概率法分析NF-κBP65、 pSTAT3/STAT3和NCOA5的蛋白表达与肝癌患者一般临床特征(性别、年龄、血清AFP水平、肝硬化背景、糖尿病背景、肿瘤大小和病理分级)的关系。运用log-rank单因素生存分析研究NF-κBP65、pSTAT3/STAT3和NCOA5的蛋白表达与肝癌患者预后的关系。结果1.普通HCC患者与糖尿病HCC患者的临床差异2003.1-2012.12年南方医科大学附属南方医院诊断为HCC患者符合筛查条件共2897人,其中男性2588人(89.3%)；平均年龄为52.04±12.07岁；943人(32.6%)合并有门静脉癌栓(包括门静脉分支及主干癌栓形成)；311人(10.7%)并发有消化道出血；547人(18.9%)发生淋巴结和(或)远处转移。患者在初诊为HCC时发现452名合并糖尿病患者为糖尿病组(15.6%),其余2445名非糖尿病HCC患者为非糖尿病组。糖尿病HCC患者平均发病年龄为56.50±14.20岁,显著高于非糖尿病组的44.51±11.80岁(P<0.05)。两组之间临床BCLC分期存在显著差异(P<0.05),糖尿病组进展期和终末期HCC患者占50.0%,非糖尿病组进展期和终末期的患者比例为39.3%,糖尿病HCC组显著高于非糖尿HCC组(P<0.05)；糖尿病组患者发生转移的共有113人,显著高于非糖尿组患者转移率(25.0%VS.17.8%,P<0.05)。糖尿病HCC患者合并有门静脉癌栓的比例显著高于非糖尿病组HCC患者(45.6%VS.30.1%,P<0.05)；糖尿病HCC患者并发消化道出血的比例也显著高于非糖尿病组(13.5%VS.10.2%,P<0.05)。2.HBV感染和肝硬化背景下的行TACE治疗的HCC患者的一般临床特征在2897名HCC患者中同时伴有HBV感染和肝硬化,并仅行TACE治疗的共290例,其中46(15.86%)例为糖尿病HCC患者,271(93.44%)例患者为男性,肝癌患者的平均年龄为51.85±12.20岁,平均肿瘤大小为7.0cm,137(47.24%)例患者BCLC分期为肝癌晚期C期。3.糖尿病与HCC患者的肝功能状况显著相关在TACE治疗前,糖尿病HCC组患者Child-Pugh评分显著高于非糖尿病HCC组(6VS.5,P<0.05),主要反映在糖尿病HCC患者有显著的低血清ALB水平(33.8VS.37.1,P<0.001)和显著延长的PT时间(14.0VS.12.7,P<0.05),但两组的血清TBIL, AST和ALT水平无统计学差异(P>0.05)。TACE治疗后糖尿病HCC患者Child-Pugh评分仍显著高于非糖尿病组(8VS.6,P<0.001),除了低水平的ALB水平(30.6VS.33.1,P<0.05)和延长的PT时间外(14.8VS.13.3,P<0.05),糖尿病肝癌患者治疗后TBIL水平也显著高于非糖尿病肝癌患者(34.0VS.26.8,P<0.001)。4.糖尿病与HCC患者TACE治疗前后肝功能变化幅度显著相关Spearman相关分析显示HCC患者TACE治疗前Child-Pugh评分较高与糖尿病背景(r=0.180,P<0.05)、肿瘤大、(r=0.150,P<0.05)、BCLC分期(r=0.139,P<0.05)有正相关关系。治疗后Child-Pugh评分也较高与糖尿病(r=0.286,P<0.001)和肿瘤大小(r=0.250,P<0.05)有显著正相关关系。但对肝癌患者TACE治疗后Child-Pugh评分变化幅度与一般临床特征的相关关系分析,发现治疗后Child-Pugh升高幅度增加仅与糖尿病有正相关关系(r=0.188,P<0.05)。5.糖尿病是有HBV感染和肝硬化的HCC患者TACE治疗的不良预后因素之一290例患者中位总生存时间为20个月。糖尿病组的中位生总生存时间为11个月,显著低于非糖尿病组的21个月(P=0.031)。单因素生存分析结果发现血清AFP水平、肿瘤大小、BCLC分期、糖尿病和治疗前后Child-Pugh评分均与病人的生存时间密切相关(P<0.05)。COX多因素分析表明除了血清AFP水平(RR:1.701;95%CI:1.161-2.492; P<0.05)、BCLC分期(RR：1.831；95%CI：1.357-2.471；P<0.001)和治疗前Child-Pugh评分(]RR:1.601;95%CI:1.081-2.370;P<0.05)外,糖尿病也是HBV感染和肝硬化背景下的HCC患者TACE治疗后的独立预后因素之一(RR:1.923;95%CI:1.135-3.259;P<0.05)。6.肝癌组织中NF-κBP65、pSTAT3/STAT3、NCOA5和CD34的表达情况免疫组织化学结果显示64例肝癌组织中NF-KBP65表达显著高于癌旁组织(P<0.05); NCOA5蛋白在肝癌组织中表达水平明显下降(P<0.05); STAT3总蛋白在癌组织表达也显著高于癌旁组织,其活化形成pSTAT3的蛋白表达在癌组织明显上调(P<0.05)；患者癌组织的微血管密度(microvessel density MVD)为19.94±16.06,显著高于癌旁组织的3.44±6.30(P<0.05)。7.糖尿病HCC组织中NF-κBP65、pSTAT3/STAT3、NCOA5和CD34的表达在31例糖尿病HCC组织中NF-κBP65阳性表达率显著高于非糖尿病HCC组织的阳性表达率(90.3%VS.57.6%, P<0.05);糖尿病HCC组织中pSTAT3的阳性表达率显著高于非糖尿病HCC组织(80.6%VS.42.4%,P<0.05)；糖尿病HCC组织中STAT3阳性表达率显著高于非糖尿病HCC组织(90.3%VS.69.7%,P<0.05)；糖尿病HCC组织中NCOA5阳性表达率显著低于非糖尿病HCC组织的阳性表达率(16.1%VS.39.4%,P<0.05)。糖尿病HCC患者癌组织的中位MVD为17.8,非糖尿病HCC患者的中位MVD为16.6,两者之间无显著差异(P>0.05)。进一步的相关分析显示在糖尿病HCC组织中NF-κBP65蛋白表达和pSTAT3蛋白表达呈显著正相关关系(P<0.001),而且两者之间相关关系密切(r=0.67)。糖尿病HCC组织中NF-κBP65、pSTAT3蛋白表达均和NCOA5蛋白表达呈显著负相关关系(P<0.05)8. NF-κBP65、pSTAT3/STAT3和NCOA5的蛋白表达与肝癌患者临床病例特征和预后的关系。NF-κBP65在肝癌组织的蛋白表达水平和患者年龄、性别、肿瘤大小、血清AFP水平无关,而与肿瘤分化较差,有糖尿病背景和(或)肝硬化背景有关(P<0.05)。NCOA5蛋白在肝癌组织中表达水平和患者的糖尿病背景相关(P<0.05). pSTAT3在肝癌组织的蛋白表达水平和患者的年龄、性别、血清AFP水平无关,而与肿瘤低分化,肿瘤体积较大、肝硬化和糖尿病背景相关(P<0.05)。总STAT3蛋白表达也和糖尿病背景相关(P<0.05)。64例肝癌患者中位总生存时间为35个月,log-rank生存分析发现NF-κBP65、 pSTAT3、STAT3和NCOA5蛋白表达水平和肝癌患者的总生存期无统计学相关性(P>0.05)。结论：1.糖尿病是HCC的危险因素之一,与肝细胞癌分期、转移、门静脉侵犯和消化道出血显著相关。2.糖尿病与有HBV感染和肝硬化的HCC患者TACE治疗前后肝功能恶化程度有关,而且糖尿病可能是HCC患者TACE治疗后的独立不良预后因素之一。3. NF-κB、pSTAT3在糖尿病肝癌组织表达显著高于非糖尿病肝癌,NCOA5在糖尿病肝癌组织表达显著低于非糖尿病肝癌,提示糖尿病导致的肝癌发展、转移等可能与NF-κB、pSTAT3和NCOA5蛋白表达有关。