第一部分调控小细胞肺癌侵袭转移能力的miRNAs的初步筛选目的：筛选调控小细胞肺癌侵袭转移能力的miRNAs。方法：利用miRNA微阵列芯片(microArrays)技术分析广泛期和局限期小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)患者血清中miRNAs的表达差异。选择合适的外参作为血清miRNA参照物,绘制加样扩增曲线计算得到最佳上样浓度。利用Prism5设计合理的miRNA逆转录茎环引物及Realtime-PCR(以下简称RT-PCR)引物,调节引物浓度,保证RT-PCR结果真实可信。RT-PCR技术检测31例SCLC患者血清中miRNAs的表达,进一步证实microArray检测结果。RT-PCR技术检测21例SCLC患者肺癌组织中miRNAs的表达,分析其与血清miRNAs的相关度及与SCLC分期的关系。使用筛选出的miRNAs进行COX单因素分析、Kaplan-Meier生存分析以及COX多因素回归分析对患者无进展生存期(progression free survival, PFS)进行预后分析。结果：miRNA micro Arrays结果显示广泛期和局限期SCLC患者血清中存在显著差异的miRNAs包括(本文无特殊说明所涉及组间对比均为SCLC广泛期vs.局限期；miRNA无特殊说明均为人类来源hsa-miRNA)：上调：miR-874(p=0.038)、 miR-3074-5p(p<0.001)、miR-574-5p(p=0.014)、miR-30e-5p(p=0.040)、 miR-4746-3p(p<0.001)、miR-4685-3p(p<0.001);下调：miR-718(p=0.01)、miR-184(p=0.001)、miR-1249(p=0.046)、miR-4253(p=0.038)、miR-4459(p=0.030)、 miR-4298(p=0.033)、miR-4706(p<0.001)、miR-4655-5p(p=0.040)、 miRNA-671-5p(p=0.026)、外参选择cel-mir-39-3p,每500μ1血清加入25fmolcel-mir-39-3p。miRNA引物设计合理,效率稳定,扩增单一。RT-PCR结果显示广泛期和局限期SCLC患者血清中存在显著差异的miRNAs包括：上调：mir-3074-5p(p=0.026)、miR-574-5p(p=0.010)、miR-4685-5p(p=0.026)、 miR-4746-3p(p=0.019)、miR-874(p=0.015);下调：miR-184(p=0.002)、 miR-4459(p<0.001)、miR-4298(p=0.017)、miR-4706(p=0.019)。广泛期和局限期SCLC患者原位肺癌组织中存在显著差异的miRNAs包括：上调：miR-574-5p(p<0.001)、miR-4746-3p(p=0.001);下调：miR-184(p<0.001) miR-4706(p<0.001)、miR-4298(p=0.001)、miR-4459(p=0.012)。SCLC患者血清与原位肺癌组织存在显著关联的miRNAs包括：miR-184(p<0.001,r=0.978)、 miR-4298(p<0.001,r=0.966)、miR-574-5p(p<0.001,r=0.875)、miR-4459(p<0.001,r=0.844)、 miR-3074-5p(p<0.001,r=0.843)、miR-4706(p<0.001,r=0.725)。COX单因素分析发现miR-3074-5p (p=0.039)、miR-574-5p (p=0.003)以及肿瘤远转状态p<0.001)为SCLC患者预后危险因素,miR-184(p=0.001)和niR-4459(p=0.005)为SCLC患者有利预后因素。Kaplan-Meier生存分析(Log-Rank analysis)发现miR-184(p<0.001),miR-574-5p(p=0.001),miR-4459(p=0.04)以及远转状态(p<0.001)与患者PFS存在显著关联。COX多因素回归分析发现miR-574-5p(p<0.001)及远转状态(p<0.001)是影响SCLC患者PFS的独立危险因素。结论：①广泛期和局限期SCLC患者血清和组织中niRNAs的表达存在显著差异；②CLC患者血清与原位肺癌组织miRNAs表达存在显著关联；③hsa-mir-574-5p和肿瘤远转为影响SCLC患者PFS的独立危险因素。第二部分候选miRNAs对SCLC细胞株H446生物学行为的影响目的：研究候选miRNAs对SCLC细胞株H446生物学行为的影响,进一步确定影响SCLC侵袭迁移能力的niRNAs。方法：RT-PCR检测H446细胞转染miRNA模拟物(mimic)及拮抗剂(inhibitor)的转染效率。MTT法检测候选miRNAs对H446细胞生长的影响,进一步使用克隆形成及生长曲线对其进行验证。划痕实验、Transwell小室(invasion/migration)实验检测候选miRNAs对H446细胞侵袭迁移能力的影响。细胞三维培养法检测候选miRNAs对H446成管能力的影响。RT-PCR法检测H446及人成纤维上皮细胞HFL-1细胞及其培养基miRNAs的表达差异,研究目的miRNAs是否在SCLC细胞系和正常肺来源细胞系间存在差异。结果：选择miR-3074-5p、miR-574-5p、miR-4685-5p、miR-4746-3p、miR-874、 miR-184、miR-4459、miR-4298、miR-4706作为候选miRNAs研究其对SCLC细胞株H446生物学行为的影响。miRNA mimics及inhibitors转染效率经RT-PCR检测,均可使相应miRNA在24h、48h、72h的表达明显增加或减少(p<0.05)。MTT结果显示miR-3074-5p可以促进H446的增殖(48h:p=0.01、72h:p=0.003),而miR-3074-5p inhibitor则可以抑制H446的增殖(48h:p=0.013、72h:p=0.002)。 RT-PCR发现miR-3074-5p mimic的转染效率至第5天(p<0.001)、第7天p<0.001)、第10天p=0.001)、第15天(p=0.002)仍然存在显著表达增加,niR-3074-5p inhibitor的转染效率从第7天开始抑制率明显下降,不具有表达差异。平板克隆形成实验显示miR-3074-5p mimic可明显促进H446生长(p=0.005)。生长曲线结果显示miR-3074-5p mimic可促进H446生长：第3天(p=0.008)、第5天(p=0.027)、第7天(p=0.001)、第10天p=0.012)。划痕实验发现,划痕后12h, miR-574-5p mimic(p=0.001)或miR-184inhibitor(p=0.033)可促进H446迁移,而1niR-574-5p inhibitor(p=0.046)或miR-184mimic(p=0.042)可抑制H446迁移；此现象至划痕后24h更为明显,hsa-mir-184mimic (p=0.003)或hsa-mir-574-5p inhibitor(p=0.000)抑制H446迁移,而miR-184inhibitor (p=0.003)或miR-574-5p mimic (p=0.003)促进H446迁移。Transwell迁移(migration)实验证实,miR-574-5p mimic(p<0.001)或niR-184inhibitor(p<0.001)可促进H446迁移,而miR-574-5p inhibitor(p<0.001)或miR-184mimic(p<0.001)则抑制H446迁移。Transwell侵袭(invasion)实验发现,miR-574-5p mimic(p<0.001)或niR-184inhibitor(p<0.001)可以促进H446侵袭,而miR-574-5p inhibitor(p<0.001)或miR-184mimic(p=0.001)则可以抑制H446侵袭。细胞三维培养发现,转染miR-184mimic的H446培养6h后其成管面积(p<0.001)和成管长度(p<0.001)均出现明显下降；10h后其成管面积(p<0.001)和成管长度(p=0.002)较NC组抑制效应依旧存在。RT-PCR结果显示H446培养基中miR-184(p=0.001)及niR-574-5p(p=0.013)的表达较RPMI1640均明显升高；转染miR-574-5p mimic后H446细胞培养基内miR-574-5p的含量较转染前明显增多(p=0.002),而转染miR-184mimic后H446细胞培养基内miR-184的含量较转染前虽然有所上升,但其结果不具有统计学差异(p=0.062)。HFL-1培养基中miR-184(p=0.002)及miR-574-5p (p=0.033)的表达较F12K也明显升高。H446培养基中miR-184(p=0.01)及miR-574-5p(p=0.013)均较HFL-1培养基明显升高并具有统计学差异。结论：①miR-3074-5p可以促进H446的生长；②miR-184可以抑制H446的侵袭迁移能力,miR-574-5p可以促进H446的侵袭迁移能力；③miR-184可以抑制H446血管拟态形成能力；④miR-574-5p在SCLC细胞中较肺成纤维细胞表达高；⑤iR-574-5p和hsa-mir-184是细胞外分泌型miRNA,转染miR-574-5p mimic可以提高H446对其的分泌量。第三部分hsa-mir-574-5p及hsa-mir-184靶基因的预测及鉴定目的：hsa-mir-574-5p及hsa-mir-184靶基因的预测及鉴定。方法：使用mirWalk、mirRDB、mirRanda、Targetscan等软件网站对miR-574-5p及miR-184靶基因进行生物信息学预测分析。RT-PCR检测(?)miR-574-5p及miR-184对其预测靶基因mRNA水平的影响。Western blot检测miR-574-5p及miR-184对其预测靶基因蛋白表达水平的影响。构建靶基因3’UTR区野生型及突变型质粒载体,与miRNA模拟物共转染H446细胞,进行双荧光素酶报告基因实验,证实miRNA的直接作用靶点。结果：生物信息学预测niR-574-5p和miR-184与靶基因3’UTR区的结合位点并选定具有侵袭迁移能力报道的PTPRU和EPAS1做为目的基因进行验证。RT-PCR结果发现, miR-574-5p mimic可以抑制H446内PTPRU mRNA的表达(p=0.008),而miR-574-5p inhibitor则可以促进H446内PTPRU mRNA的表达(p=0.000)；miR-184mimic可以抑制H446内EPAS1mRNA的表达(p=0.039),而miR-184inhibitor则可以促进H446内EPAS1mRNA的表达(p=0.005)。Western Blot结果发现,hsa-mir-574-5p mimic可以抑制H446内PTPRU蛋白表达,而hsa-mir-574-5p inhibitor可以促进H446内PTPRU蛋白表达；hsa-mir-184mimic可以抑制H446内EPAS1蛋白表达,而hsa-mir-184inhibitor可以促进H446内EPAS1蛋白表达。PCR及基因测序结果表明双荧光素酶报告基因质粒构建成功。双荧光素酶报告结果显示：miR-574-5p可直接作用于PTPRU的3’UTR区(p=0.004), miR-184可直接作用于EPAS1的3’UTR区(p<0.001)。结论：①TPRU是has-mir-574-5p的靶基因；②EPAS1是has-mir-184的靶基因。第四部分hsa-mir-574-5p及hsa-mir-184作用机制的初步探讨目的：初步探讨miR-574-5p及miR-184调控SCLC细胞系H446侵袭迁移能力的可能机制。方法：使用RT-PCR检测转染miR-574-5p或miR-184mimic或inhibitor48h后H446细胞内β-catenin mRNA的表达变化。Western blot检测转染miR-574-5p或miR-184mimic或inhibitor72h后H446细胞内β-catenin总蛋白及酪氨酸磷酸化蛋白的表达变化。结果：RT-PCR结果发现,miR-184mimic可以抑制H446细胞内β-catenin mRNA表达(p=0.000), miR-184inhibitor则可以促进细胞内β-catenin mRNA表达(p=0.005),结果均具有统计学意义；而miR-574-5p mimic (p=0.608)或miR-574-5p inhibitor (p=0.273)对H446内β-catenin mRNA表达量无明显影响。Western Blot结果证实,miR-184mimic可以抑制H446内β-catenin的表达,miR-184inhibitor则可以促进H446内β-catenin表达。而miR-574-5p mimic或miR-574-5p inhibitor对H446内总β-catenin表达量无明显影响,但miR-57-5p mimic可使H446内β-catenin酪氨酸磷酸化程度明显增高,反之,miR-57-5p inhibitor可使H446内β-catenin酪氨酸磷酸化程度明显降低。结论：(DmiR-184可以抑制H446中β-catenin mRNA及蛋白的表达；②miR-574-5p可以抑制H446中β-catenin的去酪氨酸磷酸化过程。