研究背景牙列的缺损与缺失是威胁人类健康的常见疾病,口腔种植牙技术是牙列缺损缺失修复治疗的有效手段,目前已广泛应用于临床。其中钛及钛合金种植体凭借其良好的生物相容性、耐腐蚀性、较高的机械强度等优点广泛应用于临床。虽然钛材料具有良好的生物相容性,但是其暴露于空气中5 min即可在表面形成一层二氧化钛薄膜,表现为生物惰性,影响了种植体与周围骨组织之间的结合。另外,种植体与周围骨组织的结合方式为机械结合,而非强有力的化学结合,主要依靠成骨相关细胞分化产生的骨组织嵌入种植体表面形成机械结合,因此其结合强度与种植体表面形貌有关。为了改善种植体表面形貌,提高其与周围骨组织的结合能力,缩短种植体愈合周期,进而提高其临床治疗的成功率,研究人员采用多种方法对种植体表面进行改性。常用的改性方法包括物理改性、化学改性以及电化学改性。目前趋向于复合两种以上的方法,即依次采用不同的手段,在种植体表面形成复合的形态特征,从而达到优化种植体表面结构并增加其表面活性的目的。随着纳米技术的不断发展,纳米改性处理可使种植体表面更好地模拟细胞外基质蛋白等纳米尺寸结构,因此更接近于生物体内的微环境。目前,通过阳极氧化法可以在钛片表面形成整齐均一的纳米管状结构,其具有纳米结构的尺寸效应及量子效应,具有更大的比表面积,更有利于蛋白分子的粘附和沉积。同时这种纳米管状结构具有加载药物及生物活性因子的潜能,因此在种植体改性方面受到广泛关注。淫羊藿苷(C33H40O15,分子量为676.67)是一种非常重要的用于治疗骨质疏松的中药成分。许多研究证实其可以促进成骨细胞增殖及成骨相关基因的表达,同时能够抑制破骨细胞的活性,因此有利于骨质疏松患者骨组织的愈合。另外淫羊藿苷还具有提取工艺简单、化学性质稳定、易于储存等优点,因此逐渐应用于骨组织工程方面,但是其在种植体涂层方面的研究非常少见。层层自组装技术是上世纪90年代快速发展起来的一种简易、多功能的表面修饰方法,利用带相反电荷的聚阴离子材料与聚阳离子材料的交替沉积来制备聚电解质自组装多层膜。目前已有大量研究利用该技术制备壳聚糖/透明质酸钠、壳聚糖/DNA、壳聚糖/明胶等多种自组装膜,应用于骨组织工程领域及种植体表面改性方面。壳聚糖是一种可降解的、无毒的天然糖类,具有良好的生物相容性及止血抗菌效果。有研究将壳聚糖、明胶混合制备出生物支架,表现出较好的亲水性及细胞粘附分化能力。另外,壳聚糖、明胶具有骨诱导能力,增强了其在骨组织工程领域的应用前景,可以作为种植体改性的良好涂层材料。因此,本研究拟利用阳极氧化法制备不同管径的纳米管,并利用纳米管结构较强的吸附能力负载淫羊藿苷,探索淫羊藿苷的缓释时间及改性后的种植体对骨髓间充质干细胞生物活性的影响；筛选出较为理想的二氧化钛纳米管和淫羊藿苷的结合方式,进一步在纳米管表面进行壳聚糖/明胶自组装涂层,以期更好地模拟种植体周围的微环境,探索其对成骨细胞的影响。研究目的1.采用阳极氧化法成功制备不同管径的二氧化钛纳米管2.探索不同管径的二氧化钛纳米管对淫羊藿苷的负载及缓释能力3.探索淫羊藿苷改性后的二氧化钛纳米管对骨髓间充质干细胞的影响4. 采用旋转涂布法成功构建壳聚糖/明胶多层膜结构5.探索壳聚糖/明胶多层膜对淫羊藿苷缓释时间的影响6. 壳聚糖/明胶复合涂层改性二氧化钛纳米管对成骨细胞的影响本论文主要包括以下两章内容：第一章二氧化钛纳米管负载淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞的影响材料与方法1.骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定1)骨髓间充质干细胞的分离培养无菌条件下分离SD大鼠的胫骨及股骨,剪掉其干骺端,使用注射器吸取完全培养基反复冲洗骨髓腔。将含有骨髓的完全培养基离心后重悬,37℃C、5%CO2孵箱内常规培养。2)生长曲线的测定取第2代生长状态良好的细胞,采用MTT法检测细胞培养1、3、5、7、9 d后的吸光光度值,绘制细胞生长曲线。3)表面标志物的检测取第3代生长状态良好的细胞,流式细胞仪检测间充质干细胞表面标志物CD 29、CD 44、CD 90以及造血干细胞表面标志物CD 45和CD 34的表达。4)多向分化能力的检测取第2代骨髓间充质干细胞,以5×104/孔的密度接种于培养皿中,成骨诱导培养21d,成脂诱导培养14d,分别使用茜素红及油红“O”染色,倒置显微镜下观察。2.TiO2纳米管的制备及淫羊藿苷的负载1)TiO2纳米管的制备通过阳极氧化法在纯钛片表面分别制备30 nm和80 nm两种不同管径的纳米管,得到表面规整的纳米结构形貌。2)淫羊藿苷的负载采用无水乙醇IDMSO作为有机溶剂溶解淫羊藿苷,并通过物理吸附的方法将钛片浸泡于不同浓度的淫羊藿苷溶液中,超声处理后于空气中干燥。3)TiO2纳米管的表征通过场发射扫描电镜观察阳极氧化处理前后钛片表面形貌,通过水接触角分析仪测定淫羊藿苷负载后各组钛片表面的亲水性。4)淫羊藿苷缓释时间的检测分别将负载不同浓度淫羊藿苷的钛片置于PBS缓冲溶液中,于预定的时间点取出PBS溶液,采用高效液相色谱仪测定淫羊藿苷的缓释浓度。3.TiO2纳米管负载淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞粘附、增殖、迁移及分化的影响1)细胞骨架观察将细胞以1×104/孔的密度接种于钛片上,培养24 h使用4%多聚甲醛进行细胞固定,加入TRITC Phalladin避光染色40 min,再加DAPI染色约1 min,PBS缓冲液冲洗。倒置荧光显微镜观察细胞粘附伸展的形态。2)细胞迁移实验将钛片置于24孔培养板中,每孔加入1×105/mL细胞悬液1 mL。培养36 h后,采用已灭菌的20μL枪头垂直于钛片划痕,继续培养24 h后进行染色,倒置荧光显微镜下观察。3)细胞粘附与增殖实验将生长状态良好的细胞接种于各组钛片表面进行培养,分别于选定的时间点采用CCK-8试剂检测细胞的吸光光度值,计算细胞的粘附及增殖水平。4)成骨相关基因的表达采用qRT-PCR法检测各组钛片表面细胞表达成骨相关基因骨钙素、Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、骨涎蛋白以及Runt相关基因2的水平变化。采用碱性磷酸酶试剂盒检测各组细胞碱性磷酸酶活性的差异。5)统计分析采用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计学分析,测定结果均以x±s表示,组间采用单因素方差分析(One Way ANOVA),检验方差齐性,如果方差齐则对样本均数进行两两比较的LSD检验；如果方差不齐则采用Dunnett’sT3检验进行两两比较,假设检验为双侧检验,检验水准a=0.05。结果1.采用全骨髓贴壁培养法获得生长状态良好的骨髓间充质干细胞。流式细胞术及多向分化检测结果显示,所培养的细胞具有间充质干细胞特性及多向分化潜能。2.采用阳极氧化法以乙二醇为主要电解液制备出的纳米管管壁光滑,管径均匀。当电压为10v,20v,30v时制备的纳米管管径分别约为30 nm,50 nm, 80 nm。3.纳米管处理后的钛片表面接触角较纯钛片明显降低,并且80 nm管径钛片接触角较30 nm管径的接触角小。而淫羊藿苷负载后,钛片表面的接触角变化不明显。4.高效液相色谱仪检测淫羊藿苷的缓释时间及缓释量,各组淫羊藿苷可以缓释达3d,第1d释放的量较多,之后释放速率较平缓。纳米管管径越大,淫羊藿苷浓度越高,负载的量越多。5.细胞骨架：倒置荧光显微镜观察可见纯钛组的细胞体积较小,细胞突起较少；NT1o组细胞有较多的板状足,而NT30组细胞伸出较多丝状伪足,淫羊藿苷加载后细胞形态改变不明显。6.细胞迁移：骨髓间充质干细胞在10v电压处理的纳米管组迁移能力稍优于纯钛组及30v电压处理的各组,其中NT10+ICA0.05组细胞迁移能力最强,提示淫羊藿苷负载后有利于骨髓间充质干细胞的迁移。7.细胞粘附与增殖：在各个时间点纯钛组及10v处理组粘附的细胞数目较多,明显多于30v处理组,2h和4h时差异有统计学意义。淫羊藿苷的负载未能明显促进细胞早期粘附。增殖测试结果显示细胞培养第1d各实验组与纯钛组相比均无显著差异；第3d及第5d纯钛组及10v电压处理组间差异无统计学意义,明显高于30v电压处理的各组；第7dNT30+ICA0.05组的细胞增殖能力最强,明显高于其他组,提示淫羊藿苷促进了细胞增殖。8.纳米管处理后上调了成骨相关基因的表达,尤其是骨钙素、骨桥蛋白和骨涎蛋白,而对Ⅰ型胶原及Runt相关基因2的影响较小。淫羊藿苷负载组进一步上调了部分成骨相关基因的表达。9.除了NT10+ICA0.05组及NT30+ICA0.05组在第7d碱性磷酸酶的活性增高外,其他各组在7d和14d碱性磷酸酶的表达无显著差异。第二章壳聚糖/明胶多层膜改性二氧化钛纳米管对成骨细胞的影响材料与方法1.大鼠原代成骨细胞的分离培养及鉴定本实验通过胰蛋白酶、胶原酶消化法获得SD乳鼠的颅骨成骨细胞,采用差速贴壁法纯化成骨细胞,观察其形态学特性。通过碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色以及矿化结节茜素红染色对成骨细胞特性进行鉴定。2.壳聚糖/明胶多层膜改性TiO2纳米管的制备及表征1)配制壳聚糖溶液和明胶溶液,浓度均为10 mg/mL。采用旋转涂布法在纳米管表面交互涂布壳聚糖和明胶,旋转速度为4000rpm,每层旋转时间为40s。共涂布层数记为T/(Chi/Gel)5Chi和T/ICA/(Chi/Gel)5Chi。2)采用接触角分析仪测量水滴在钛片表面的静态接触角大小；X射线光电子能谱仪分析各组钛片表面元素的化合状态；原子力显微镜对各组钛片表面进行面扫描,分析钛片表面形貌结构及表面粗糙度；高效液相色谱仪测定淫羊藿苷的缓释时间。3.壳聚糖/明胶多层膜改性TiO2纳米管对成骨细胞粘附、增殖及分化的影响1)细胞骨架取生长状态良好的成骨细胞以2×104/mL的密度接种于钛片上,培养1d后取出钛片,进行免疫荧光染色,倒置荧光显微镜观察细胞形态。2)细胞增殖取第3代生长状态良好的成骨细胞,以2×104/mL的密度接种于各组钛片表面,分别培养1、3、5、7 d,采用CCK-8试剂检测成骨细胞相对增殖水平。3)成骨相关基因表达qRT-PCR法检测各组钛片表面成骨基因Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、骨保护素及破骨细胞分化因子RANKL mRNA水平的表达。4)碱性磷酸酶活性检测分别在培养7d和14d后收集细胞培养液,根据试剂盒说明检测各组碱性磷酸酶分泌量。5) Western Blot检测成骨相关蛋白表达细胞接种于各组钛片表面,培养10d后提取细胞内的蛋白,通过Western Blot检测各组细胞骨桥蛋白及Ⅰ型胶原蛋白的表达水平。6)统计分析采用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计学分析,测定结果均以x±s来表示,组间采用单因素方差分析(One Way ANOVA),检验方差齐性,如果方差齐则进一步对样本均数进行两两比较的LSD检验；反之,如果方差不齐则采用Dunnett’s T3检验进行两两比较,假设检验为双侧检验,检验水准α=0.05。结果1.原代成骨细胞的培养与鉴定通过酶消化法及差速贴壁法分离纯化后,可获得生长状态良好的成骨细胞。碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原表达阳性,成骨诱导培养后可见矿化结节形成,符合成骨细胞特性。2.壳聚糖/明胶多层膜改性二氧化钛纳米管的表征1)原子力显微镜检测结果：纯钛片的粗糙度最小；纳米管改性处理后,粗糙度明显增大；淫羊藿苷的负载未明显影响钛片表面形貌；壳聚糖/明胶多层膜处理后粗糙度降低。2)光电子能谱及接触角测试结果：壳聚糖/明胶多层膜完全覆盖钛片表面,表明已成功构建多层膜结构。3.壳聚糖/明胶多层膜改性TiO2纳米管对成骨细胞粘附、增殖及分化的影响1)细胞骨架在倒置荧光显微镜下观察可见,成骨细胞在纯钛表面铺展充分,形态不规则,有较多细长的伪足；纳米管组表面细胞体积变小,细胞伸展不充分,细胞突起较少；淫羊藿苷的负载未明显改变细胞形态；经壳聚糖/明胶多层膜涂层后细胞铺展较好,细胞呈现大量的板足及伪足,并且T+ICA+LBL组细胞铺展较T+LBL组更加充分,细胞板状足更多。2)细胞增殖实验培养第1d时,纳米管组细胞增殖数目最低,其他组之间的差异无统计学意义。培养3、5、7 d时,T+ICA+LBL组细胞增殖明显高于其他组,其次为T+LBL组,较其他组细胞增殖数目多,并且在第7d表现出统计学差异。在各个时间点,T+ICA组均大于NT组,说明淫羊藿苷提高了细胞的增殖。3)成骨相关基因的表达成骨细胞在各组钛片表面培养7d和14d之后,各实验组与对照组成骨相关基因的表达存在差异。在7d时,T+ICA组的Ⅰ型胶原表达水平高于T+LBL组,其余各组无统计学差异。各组的骨桥蛋白表达水平无显著差异。T+ICA组的骨保护素表达水平明显高于T+LBL组,且NT组及T+LBL组表达低于纯钛组,差异有统计学意义。各实验组RANKL的表达明显低于纯钛组。培养14d后,各实验组Ⅰ型胶原及骨桥蛋白的表达明显高于纯钛组,而骨保护素及RANKL的表达在各组之间差异无统计学意义。4)碱性磷酸酶活性检测细胞培养7d时T+ICA+LBL以及T+ICA组碱性磷酸酶的表达水平明显高于纯钛组；培养14d各组差异无统计学意义。5) Ⅰ型胶原和骨桥蛋白的表达除了NT组,各实验组骨桥蛋白的表达均显著高于纯钛组；T+ICA+LBL及T+ICA的Ⅰ型胶原表达明显高于其他组,差异有统计学意义。结论1.通过全骨髓贴壁培养法成功获得骨髓间充质干细胞。2.采用阳极氧化法成功制备TiO2纳米管,并通过物理吸附法负载淫羊藿昔。各组纳米管的淫羊藿苷可以缓释长达3 d。3.TiO2纳米管负载淫羊藿苷可以提高骨髓间充质干细胞的粘附、迁移及矿化相关基因的表达。4.通过酶消化法成功获得原代成骨细胞,并通过差速贴壁法纯化细胞。5.通过旋转涂布法成功构建壳聚糖/明胶多层膜结构,多层膜结构延长了淫羊藿苷的缓释时间,可缓释5 d。6.壳聚糖/明胶多层膜改性后的纳米管及淫羊藿苷的负载有利于成骨细胞的增殖及粘附,可以上调矿化相关蛋白的表达。