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小胶质细胞作为中枢神经系统内重要的免疫细胞,具有分泌细胞因子、呈递抗原及吞噬病原体等多种功能。研究显示黑质纹状体系统是帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)主要的病理改变部位,黑质致密带(substantia nigra par compacta,SNpc)多巴胺(dopamine,DA)能神经元对小胶质细胞介导的炎症反应非常敏感。尸检结果显示PD患者的黑质含有大量的反应性小胶质细胞和星形胶质细胞,提示免疫炎症在PD的发病中发挥重要的作用。因此通过抑制炎症反应保护中脑黑质DA能神经元成为PD治疗的一种新策略。人参皂苷Rg1是我国传统中药人参的主要活性成分,具有多种生理及药理作用,特别是对中枢神经系统,Rg1具有神经营养和神经保护作用,能够抑制小胶质细胞的炎症反应,但Rg1是通过何种机制作用于小胶质细胞发挥其抗炎作用,目前尚不清楚。Rg1具有类固醇激素样的甾体骨架结构,本课题组及其他研究小组的研究结果均揭示Rg1可通过类雌激素样和类糖皮质激素样的特性,发挥其生物学作用。研究显示Rg1是糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)的功能性配体,可激活GR。GR属于核受体超家族,研究结果显示,小胶质细胞中GR与其配体结合后激活,可通过抑制小胶质细胞的炎性反应,发挥其对DA能神经元的保护作用。因此本研究第一部分采用SN微量注射脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)制备去卵巢(ovaryectomy,OVX)PD炎症大鼠模型,探讨人参皂苷Rg1是否能够通过GR抑制胶质细胞的炎症反应,保护中脑黑质DA能神经元?雌激素受体(estrogen receptor,ER)也是核受体超家族中的一员,其基因组作用是通过经典的核受体ERa和ERb来介导的。近年来的研究显示雌激素的非基因组作用由膜表面的雌激素受体即G蛋白偶联雌激素受体(G protein-coupled estrogen receptor 1,GPER1)介导。雌激素可通过GPER1介导的快速非基因组效应发挥其抗炎和抗凋亡等作用。研究显示GPER1被激活后,可以通过与胰岛素样生长因子-I受体(insulin-like growth factor-I receptor,IGF-IR)或表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)等信号途径的交互作用,快速影响细胞的生理反应。此外,GPER1可以通过上述信号途径,通过非配体依赖的方式引起ERa的磷酸化反应,激活ERa。本课题组前期工作证实Rg1是一种新的植物雌激素,受体结合实验结果显示Rg1并不能与经典的雌激素核受体ERa和ERb结合,但可以通过非配体依赖的方式快速激活ERa,发挥其类雌激素样作用。应用神经毒素6-OHDA制备的PD大鼠模型和细胞模型,均证实人参皂苷Rg1可以通过ER与IGF-IR信号途径的交互作用,发挥其神经保护作用。进一步的离体细胞实验显示Rg1能够通过GPER1抑制BV2小胶质细胞的炎症反应。那么,人参皂苷Rg1是否通过膜表面的雌激素受体GPER1及其与IGF-IR信号途径的交互作用,抑制大鼠小胶质细胞的炎性反应,发挥其对黑质DA能神经元的保护作用?本研究第二部分应用GPER1特异性激动剂G1作为阳性对照,深入探讨了GPER1和IGF-IR在人参皂苷Rg1抗炎机制中的作用。1.人参皂苷Rg1通过GR抑制炎症反应保护黑质多巴胺能神经元的实验研究(此部分内容已发表于Journal of Steroid Biochemistry&Molecular Biology)本研究在LPS制备的PD炎症大鼠模型上,采用腹腔注射阿扑吗啡(apomorphine,APO)诱导大鼠的旋转行为,高效液相色谱法(HPLC)检测大鼠纹状体(striatum,Str)内DA及其代谢产物高香草酸(homovanillic acid,HVA)和二羟基苯乙酸(dihydroxyphenylacetic acid,DOPAC)的含量变化,免疫组织化学法及免疫荧光观察黑质DA能神经元的损伤及小胶质细胞的激活情况,硝酸还原酶法(Gress)检测黑质内NO含量的变化,酶联免疫吸附法(ELISA)及实时荧光定量PCR技术观察黑质内炎症介质的含量及基因表达的变化,免疫印迹技术(western-blot)观察黑质内酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)、GR及炎症相关信号通路中各种蛋白表达及磷酸化的变化。实验结果如下:(1)LPS模型组,腹腔注射APO可成功诱导大鼠旋转行为,旋转圈数为9.30圈/分钟(P<0.001)。给予Rgl(10mg/kg,i.p.)处理之后,其旋转行为明显改善,约4.64圈/分钟,较LPS组明显降低(P<0.01),此作用可被GR阻断剂RU486所阻断(P<0.001)。LPS与RU486共处理对大鼠旋转行为没有影响。(2)高效液相结果显示,LPS模型组患侧Str内DA及其代谢产物DOPAC和HVA的含量较对照组明显下降,分别降低了(72%、64%和70%)(P<0.001);Rgl处理组患侧Str内DA、DOPAC和HVA的含量较LPS组均明显增加(P<0.05),且此作用可被GR阻断剂RU486所阻断(P<0.05)。(3)黑质单侧注射LPS导致患侧SN致密带TH免疫反应阳性神经元数量较健侧明显降低,存活率是健侧的36.7%。患侧黑质TH蛋白表达亦较对照组明显减少(P<0.001);给予Rgl处理后,可明显拮抗LPS诱导的TH免疫反应阳性神经元数量及蛋白表达的下降(P<0.05),此保护作用可被GR阻断剂RU486所阻断(P<0.05)。(4)免疫组化结果证实LPS模型组患侧黑质小胶质细胞数量明显增多并过度激活,给予Rgl处理后,患侧黑质小胶质细胞的数量及活化程度受到明显抑制,此抑制作用亦可被GR阻断剂RU486所阻断。(5)LPS模型组患侧黑质炎症介质NO、TNF-a及IL-1β的分泌量明显高于对照组(P<0.001),Rgl处理组患侧黑质内NO、TNF-α及IL-1β的含量较LPS组患侧明显减少(P<0.01),此抑制作用可被GR阻断剂RU486所阻断(P<0.01)。(6)LPS模型组患侧与对照组相比,SN区MAPKs(ERK、JNK、P38)及I?B蛋白的磷酸化水平明显增加(P<0.01),给予Rgl处理后,可拮抗LPS诱导的MAPKS及I?B蛋白的磷酸化水平的增加(P<0.01),此抑制作用可被GR阻断剂RU486所阻断(P<0.05)。(7)LPS模型组患侧SN区GR蛋白表达量较对照组有所下降,但无统计学意义(P>0.05),Rg1处理组患侧SN区GR蛋白表达量较LPS组明显升高(P<0.05),此作用可被GR阻断剂RU486所阻断(P<0.05)。上述结果表明,Rg1能够通过GR对抗LPS诱导的黑质小胶质细胞的激活,保护中脑黑质DA能神经元。2.GPER1在人参皂苷Rg1抑制炎症反应保护黑质多巴胺能神经元中的作用在LPS制备的PD炎症大鼠模型上,应用GPER1阻断剂G15或IGF-IR阻断剂JB-1与Rg1共同作用,并应用GPER1特异性激动剂G1作为阳性对照,深入探讨了GPER1和IGF-IR在人参皂苷Rg1抗炎机制中的作用。实验结果如下:(1)Rgl或G1可明显改善APO诱导的大鼠旋转行为(P<0.001),此作用可被GPER阻断剂G15或IGF-IR阻断剂JB-1所阻断(P<0.01)。(2)Rgl或G1能够明显拮抗LPS诱导的患侧Str内DA、DOPAC和HVA含量的下降(P<0.05),G15或JB-1与Rg1共处理,能够明显抑制Rg1的保护作用(P<0.05)。(3)Rgl或G1能够拮抗LPS诱导的SN致密带TH免疫反应阳性神经元数量及蛋白表达的下降(P<0.01),此作用亦可被G15或JB-1所阻断(P<0.05)。(4)免疫荧光结果显示,LPS诱导的SN区小胶质细胞的激活,可以被Rg1或G1所拮抗。G15或JB-1与Rg1共处理,能够明显抑制Rg1的抗炎作用。同时,LPS模型组SN区致密带星形胶质细胞的数量明显减少,Rg1或G1处理组星形胶质细胞的数量较LPS组明显增加,此作用可以被G15或JB-1所阻断。(5)LPS诱导的黑质内促炎酶(i NOS和COX-2)和炎性因子(TNF-?及IL-1β)的蛋白和基因表达的增加,亦可被Rg1或G1所拮抗(P<0.05)。G15或JB-1与Rg1共处理,能够明显抑制Rg1的抗炎作用(P<0.05)。(6)Rg1或G1能够明显抑制LPS诱导的黑质区炎症信号通路(MAPKS及I?B)的激活(P<0.05),此作用可以被G15或JB-1所阻断(P<0.05)。(7)免疫共沉淀的结果显示Rg1能够促进GPER1与IGF-IR的相互作用。上述结果表明,Rg1能够通过GPER1及其与IGF-IR的交互作用,抑制黑质小胶质细胞的激活。结论:人参皂苷Rg1能够通过GR、GPER1及其与IGF-IR的交互作用,多靶点对抗LPS诱导的大鼠SN小胶质细胞的过度激活,抑制炎性因子对DA能神经元的损伤。本研究结果为PD的治疗和新药的筛选鉴定提供了实验依据。