肠炎沙门氏菌感染后济宁百日鸡盲肠组织circRNA表达谱分析

来源 :山东农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:liuyi8431201
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Circular RNA(circRNA),是一类闭合的环状RNA分子,没有5’-3’极性,主要由pre-mRNA通过可变剪切加工生成,大量存在于真核生物转录组中。CircRNAs在不同物种中具有保守性,并且存在组织表达差异,再加上circRNA的环状结构使其对核酸酶不敏感,导致它比线性RNA稳定性更好,这些特性使得circRNA具有开发疾病新型诊断与治疗方法的巨大潜力,研究意义重大。一些circRNA被证明可作为microRNA(miRNA)的海绵体(sponges),通过与miRNA进行竞争性结合在转录后发挥调控作用。近几年,随着Solexa高通量测序技术的发展已成为各物种circRNA分析鉴定的重要工具,目前在细菌、病毒感染鸡等动物的研究中都得到了广泛的应用,也证实了circRNA是一类重要的与抗细菌、病毒相关的一类小RNA。但是circRNA在鸡感染肠炎沙门氏菌后的调控机制目前还没有相关研究。  本研究利用肠炎沙门氏菌感染2日龄济宁百日鸡,感染后第7天采集盲肠样品,对照组与处理组分别构建3个circRNA文库进行测序分析。利用Solexa高通量测序技术进行分析鉴定,挑选显著差异表达的circRNA利用荧光定量PCR对测序结果进行分析验证。同时,利用荧光定量PCR分析与circRNA相关的miRNA的表达情况及其靶基因的表达变化。通过分析感染肠炎沙门氏菌后济宁百日鸡盲肠组织与海兰褐鸡盲肠组织中circRNA的表达情况来分析在不同时间点circRNA的调控机制。结果显示:  (1)通过Solexa高通量测序,在对照组和试验组(C1、C2、C3和T1、T2、T3)共六个文库中经过筛选获得Clean read分别是90530234、110491612、92320140和93383800、85106242、95054982。在C1、C2、C3和T1、T2、T3中的Mapped reads分别为89644352、109235962、91630592和93063694、84529812、94529620。Mapped reads比对效率在98.86%和99.66%之间。  (2)通过生物信息学分析,共鉴定到5118个circRNAs。处理组与对照组间共有62个显著差异表达circRNAs,包括32个上调的circRNAs和30个下调的circRNAs;  (3)采用miRanda软件对差异表达的circRNA进行相关miRNA的分析并进行靶基因预测,共预测到626个不同的相关miRNAs,由上调的差异表达circRNAs调控的有620个miRNAs;其中由下调的差异表达circRNAs调控的有473个miRNAs;再经过进一步的分析得到这些miRNA的靶基因。利用Cytoscape3.5.1软件分析了环RNA:chr16∶242878-309387相关miRNA及其靶基因的蛋白互作关系。通过与Biomart数据库中免疫相关的基因比对,共得到3个与免疫相关的来源基因。  (4)利用KOBAS3.0软件对差异表达circRNA的来源基因进行功能分析,差异表达circRNA显著富集的生物学过程主要有定位、生物粘附、免疫过程、再生过程、多器官功能、信号、节律过程、生物阶段和细胞的聚集;一共富集到15条通路,其中包括肾上腺素心肌细胞信号通路和单疱疹病毒感染通路;并对差异表达的circRNAs来源基因的同源序列进行COG功能分析,分析结果一共包含25种功能。  (5)差异表达circRNAs的QRT-PCR验证,所选3个差异表达circRNAs在济宁百日鸡感染肠炎沙门氏菌后第7天对照组与处理组盲肠组织中表达均差异显著,且都与测序结果一致。在海兰褐鸡中感染肠炎沙门氏菌后第7天circRNA chr26:2670958-2679178表达量显著下调,而在第14天circRNA chr26∶2670958-2679178表达量又表现为显著上调。  (6)CircRNAs的相关miRNA与其相关靶基因互作关系分析研究表明,在济宁百日鸡感染肠炎沙门氏菌后第7天盲肠组织中,gga-miR-34a-5p与gga-miR-1416-5p在感染肠炎沙门氏菌后在试验组和对照组中均差异显著且都表现出下调的趋势,gga-miR-34a-5p和CXCL14基因,gga-miR-1416-5p和NUMA1基因表现出明显的靶向关系。  本研究共鉴定出62个与肠炎沙门氏菌感染相关的重要候选circRNAs;定位、生物粘附、免疫过程、再生过程、多器官功能、信号、节律过程、生物阶段和细胞的聚集等生物学过程;肾上腺素心肌细胞信号通路和单疱疹病毒感染通路在鸡感染肠炎沙门氏菌后发挥重要的调控作用;gga-miR-1416-5p、gga-miR-34a-5p在肠炎沙门氏菌感染中起到重要调控作用。为深入研究circRNA在感染肠炎沙门氏菌后的作用机制奠定基础,并为鸡的分子抗病遗传育种提供理论基础和科学依据。
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