血小板减少症在临床治疗中较为常见，严重的血小板水平低下直接威胁着人体生命安全。血小板减少性紫癜、肿瘤放/化疗、再生障碍性贫血及骨髓移植等许多因素都能引起血小板减少。目前，临床上应对血小板减少的主要治疗方法仍然是直接输注血小板；然而，血小板输注存在着输血反应、病原体感染等多种隐患。已知血小板由骨髓巨核细胞产生，因而通过对巨核细胞增殖分化进行调控可以达到促进血小板生成的目的。所以，能够促进巨核细胞增殖分化的造血生长因子类基因工程药物越来越受到人们的广泛关注。血小板生成素(thrombopoietin, TPO)，也称为巨核细胞生长发育因子(megakaryocyte growth and development factor, MGDF)，是调节巨核细胞增殖分化和血小板生成的重要细胞因子，可通过与受体(c-Mpl)的结合，激活巨核细胞中相应的信号通路，发挥其促巨核细胞增殖分化的作用。人们利用基因重组方法，研制出聚乙二醇化的重组人巨核细胞生长发育因子(pegylated recombinant human megakaryocyte growthand development factor, PEG-rhMGDF)和重组人血小板生成素(recombinant humanthrombopoietin, rhTPO)两种第一代促进血小板生成基因工程药物。但是，PEG-rhMGDF在美国进行二期临床试验时，发现其能诱导产生与内源性TPO起交叉反应的中和性抗体，反而使患者血小板水平进一步降低。因此，美国FDA随即全面禁止了重组人TPO基因工程药物的临床实验。之后，人们又用噬菌体表面展示技术筛选出一种由14个氨基酸组成的TPO模拟肽(thrombopoietin mimetic peptide, TMP)，它与TPO无同源序列，但与c-Mpl具有较高亲和力。研究表明，TMP尤其是其二联体（dTMP）不仅能促进巨核细胞增殖，并且不会诱导产生TPO中和性抗体。然而，由于TMP分子量只有1.5KD，通过基因工程制备难度较大，并且在体内循环中极易被降解。已有研究表明，人生长激素(human growth hormone, hGH)对骨髓造血干细胞的增殖和/或分化具有重要调控作用，并且发现在体内应用后可加速血小板水平恢复。hGH可通过与其受体(growth hormone receptor, GHR)结合发挥生物学活性，该受体与c-Mpl为同类细胞因子受体，可激活相似的信号通路。因此，本室将GH与dTMP进行融合，构建出重组融合蛋白分子dTMP-GH，以期发挥协同促进巨核细胞增殖及血小板生成作用。另一方面，融合蛋白dTMP-GH的分子量为26KD，较单纯TMP更容易进行基因工程制备，且可望延长其体内半衰期。前期工作中，我们已构建并筛选出特异性表达dTMP-GH的工程菌株，并进行了实验室水平的小规模制备。在此基础上，为放大生产，满足新药申报要求，本研究进一步对融合蛋白dTMP-GH在大肠杆菌中的高效表达和纯化制备工艺进行了优化，最终实现了该重组融合蛋白的中试放大生产，获得纯度大于98%的目标产品，并对该融合蛋白的质量标准及体内分布进行了初步研究。主要研究结果与结论如下：1.基于已有的dTMP-GH表达菌株，通过对培养基成分、培养温度和培养时间的优化，成功将从一个单克隆到获得目的蛋白菌体整个酵表达过程控制在30小时以内，含目的蛋白的湿菌产量达50g/L，目的蛋白表达量占总蛋白的25%，高压匀浆破菌后dTMP-GH包涵体含量达到50%以上。2.为提高效率和处理量，采用超滤法代替透析法对包涵体进行复性。通过对纯化条件的优化，目前单次纯化所得融合蛋白dTMP-GH的量达到克级，产品纯度大于>98%。3.对融合蛋白dTMP-GH的分子量、等电点、氨基酸序列、纯度等理化特性及其冻干制剂成品的水分、pH值、渗透压摩尔浓度、蛋白含量、纯度、质谱分子量、质量肽谱分析、宿主菌蛋白残留、外源性DNA残留、细菌内毒素含量、热原、生物学活性等进行了检测，各项指标均达到治疗用生物制品的申报标准要求。在此基础上，与中国食品药品检定研究院共同草拟了融合蛋白dTMP-GH的质量标准草案。4.用放射性碘标记融合蛋白dTMP-GH，制备得到标记率为71.5%、放射纯度为96.5%、比活度为0.22MBq/μl的125I-dTMP-GH。BALB/c小鼠经尾静脉注射放射性125I标记的dTMP-GH后，于30分钟时股骨放射性计数达到最高值，占到注射总量的10%，随时间推移经肝、肾代谢排出体外。证实融合蛋白dTMP-GH具有明显骨髓偏向性分布特点。通过本研究，成功建立了融合蛋白dTMP-GH快速高效的中试规模制备工艺及质量标准草案。单次发酵纯化可获得克级且纯度>98%的dTMP-GH，可制备出3000支冻干产品。抽样检测结果均符合dTMP-GH质量标准要求，为融合蛋白dTMP-GH的进一步开发和申报新药奠定了基础。