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糖尿病(Diabetes mellitus,DM),作为一类慢性代谢性疾病,具有极高的发病率和高致死率,对公众的健康造成了极其严重的威胁。DM病发的主要原因是胰岛β细胞的损伤导致胰岛素分泌不足或机体利用障碍。目前,针对DM治疗的研究主要集中在β细胞再生疗法。猪胰腺干细胞(porcine pancreatic stem cells,pPSCs)是通过收集胎猪胰腺组织分离获得的一类干细胞,我们已证实该细胞可以经体外诱导分化成为具有胰岛素分泌功能的细胞(insulin-producing cells,IPCs)。同时解剖学结构显示猪和人类的胰岛结构、大小又最为相近,所以经pPSCs诱导获得的IPCs有望用于人类DM的临床治疗。叶酸(folic acid,FA),一直被认为是以维生素的角色参与DNA和RNA合成过程,影响细胞的自我更新、增殖与分化。而近期的研究表明,FA可以直接作为一种信号分子促进生殖干细胞的增殖。到目前为止,FA对pPSCs的增殖和分化的作用及机理仍不清楚。本试验针对FA对pPSCs增殖和在pPSCs向IPCs定向分化中的作用,以及FA调控pPSCs增殖和分化的机制展开了研究,得到的结果如下:1.FA通过结合叶酸受体FOLRα同时激活Wnt信号通路和ERK通路,促进pPSCs的增殖通过CCK8和EDU染色评估FA对pPSCs增殖的影响,发现FA处理组细胞EDU阳性率高、增殖速度快,说明FA促进pPSCs的增殖。qRT-PCR及Western blotting结果表明,经FA作用后,pPSCs中的PCNA、CyclinD1、c-Myc在蛋白和RNA的表达水平上均上调,进一步说明FA作用细胞增殖速度加快,而加入FA抑制剂MTX后,这些指标都降低,明确FA对pPSCs的促增殖作用。同时FA对pPSCs产生促增殖作用的同时,刺激叶酸受体FOLRα的表达上调,而干扰FOLRα表达则抑制pPSCs的增殖,说明FA通过结合叶酸受体FOLRα促进pPSCs的增殖。进一步的机制研究中,Western blotting显示,pPSCs在经FA处理后,细胞中经典Wnt信号通路和ERK信号通路中的关键蛋白activeβ-catenin和p-ERK的表达均增高,进一步地分别添加通路抑制剂对两条信号通路造成抑制后,FA对细胞的促增殖作用又明显抑制。以上结果表明FA通过结合叶酸受体FOLRα同时激活Wnt信号通路和ERK通路对pPSCs发挥促增殖的作用。2.FA可以提高pPSCs向IPCs的分化的诱导效率实验室先前的研究已经证实pPSCs可以在体外诱导成为IPCs,在此基础上添加FA来探究其对pPSCs向IPCs诱导分化的影响。检测结果显示:在诱导过程添加FA获得的细胞团中,双硫腙染色DTZ着色加深,β细胞成熟标志基因Insulin、NKX6.1、MafA、NeuroD1在mRNA水平表达升高,功能基因Insulin、C-peptide蛋白表达水平升高,同时对高糖应答分泌胰岛素能力升高。与此同时,与增殖试验类似,Western blotting检测发现诱导过程中添加FA得到的细胞团中Wnt信号通路和ERK通路的关键蛋白activeβ-catenin、p-ERK的表达均有上调;进一步在诱导过程中通过添加通路抑制剂抑制这两条通路,qRT-PCR检测发现β细胞成熟标志基因Insulin、NKX6.1、MafA、NeuroD1的表达下调,表明FA的促分化作用被抑制,说明FA对pPSCs的促分化作用同样的与Wnt信号通路和ERK通路有关。综上所述:FA结合叶酸受体FOLRα促进pPSCs的增殖;在体外诱导分化过程中FA作用会上调pPSCs向IPCs定向分化的效率;Wnt信号通路和ERK通路参与调控FA对pPSCs的促增殖和促分化作用。本研究为pPSCs治疗糖尿病的研究和临床运用提供了新的方向。