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氨基葡萄糖及其衍生物N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetyl-D-glucosamine,GlcNAc）在食品、保健品及药品领域有着广泛的应用,以维持骨关节健康、治疗骨关节疾病、增强免疫力。另外GlcNAc作为药物辅料,由于其溶解性好,安全性高,无副作用,可用于肿瘤诊断,促进药物吸收。本论文以重组枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis,B.subtilis）BSGN6为出发菌株,通过深入分析GlcNAc的合成途径,结合系统代谢工程与合成生物学的相关技术手段,平衡GlcNAc合成途径与各代谢途径之间的代谢流量,增强GlcNAc合成途径中代谢中间产物的合成,增强磷酸糖GlcNAc-6-phosphate向胞外运输,从而降低碳流的损失、提高GlcNAc的积累量,为降低生产成本,工业化生产GlcNAc奠定了基础。主要研究结果如下:1.氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶（GlmS）基因glmS的表达受到由glmS核酶开关介导的严格反馈抑制,所以GlmS催化生成氨基葡萄糖6磷酸（GlcN6P）的过程是GlcNAc合成过程中的关键限速反应。尝试不同敲除策略,敲除glmS核酶的同时,在glmS核酶5’端断裂片段下游插入trp终止子-P43启动子,有效解除了glmS核酶的反馈抑制,GlmS的表达量明显提高,GlcNAc产量由9.2 g/L提高到12.2 g/L,转化率由0.106提高到0.167 g/g葡萄糖;过表达glmS核酶5’端断裂片段能够促进细胞生长,查找glmS核酶5’端断裂片段潜在的调控靶点,利用westernblot分析,在当前条件下glmS核酶5’端断裂片段对PTS系统转运蛋白亚基IIA YpqE的表达没有调控作用。2.GlcNAc合成模块的竞争模块有糖酵解模块、肽聚糖合成模块和戊糖磷酸途径模块,为平衡各代谢模块之间的代谢流量,利用glmS核酶反馈抑制机制控制关键代谢节点6-磷酸果糖激酶（PFK）和磷酸氨基葡萄糖变位酶（GlmM）的表达,并利用glmS核酶突变体M9（断裂位点AG→CC）控制关键基因葡萄糖6磷酸异构酶基因pgi的表达,通过三个位点的协同控制,工程菌株SFMI-G细胞干重由15.26 g/L降到7.25g/L,GlcNAc产量达到16.3 g/L,副产物乙偶姻由23.8 g/L降为0,GlcNAc转化率提高到0.394 g/g葡萄糖;利用glmS核酶和RBS序列优化pfkA的表达,证明原本的多位点动态调控使代谢流分配达到最佳;利用启动子、glmS核酶突变体、RBS元件进行组合优化pgi的表达,使重组菌株N3531-G的GlcNAc产量增加至18.45 g/L,细胞干重达到15.2 g/L,副产物乙偶姻的浓度达到18.2 g/L,转化率为0.283 g/g葡萄糖。3.通过启动子工程和RBS工程提高GlcN6P乙酰转移酶（GNA1）的表达,最终GNA1的酶活提高了30%,促进GlcNAc的积累;进一步在培养基中添加TCA循环中间代谢物,发现添加谷氨酸和尿素能够促进细胞生长和GlcNAc的积累,得出胞内谷氨酸含量过低限制细胞生长和GlcNAc的积累;进一步敲除内源性谷氨酸脱氢酶基因gudB,rocG两个基因,引入来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13032的谷氨酸脱氢酶基因gdh,使重组菌株SA17的GlcNAc产量达到22.2 g/L,副产物乙偶姻的浓度为1.2g/L,转化率为0.271 g/g葡萄糖。4.增强葡萄糖非磷酸化转运途径、降低戊糖磷酸途径代谢流量,使Glc NAc合成前体GlcNAc6P过量积累,激活磷酸糖压力响应,明确GlcNAc6P去磷酸化是GlcNAc合成的限速步骤;转录组分析磷酸糖压力反应表明,细胞通过降低葡萄糖的输入和加速磷酸糖降解两种途径降低磷酸糖压力。KEGG数据库比对,筛选验证得到关键磷酸酶YwpJ,通过过表达磷酸酶YwpJ,使胞内的GlcNAc6P去磷酸化生成GlcNAc,从而释放磷酸糖压力,解除高浓度磷酸糖抑制细胞生长,有效促进了GlcNAc的合成,进一步敲除磷酸糖降解途径乙酰胞壁酸6磷酸合成酶基因murQ、氨基葡萄糖6磷酸脱氨酶基因nagBB使工程菌株FMIP34的GlcNAc产量达到26.1 g/L,转化率达到0.483 g/g葡萄糖,没有乙偶姻生成。在30 L发酵罐中通过三次补加谷氨酸和尿素,GlcNAc产量达到87.5 g/L,转化率为0.435 g/g葡萄糖,没有乙偶姻生成。