论文部分内容阅读
背景急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)是一个以非心源性水肿、广泛存在的肺部炎症和凝血功能异常为特征的一类临床综合征,在严重时可发展为急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)。ARDS 目前治疗效果不甚理想,致死率高,这往往与肺局部甚至全身炎症反应失代偿有关。ALI或ARDS的起因复杂,往往和多种病原微生物(Pathogen)或损伤原(Damagen)侵入机体,激活相关模式识别受体(Pattern recognition receptor)有关,而其中革兰氏阴性菌来源的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是小鼠模型中采用最广泛诱导ALI的物质。在静息状态下,肺部的免疫细胞处于稳态。但当LPS在内的多种致病物质刺激,肺泡巨噬细胞(Alveolarmacrophage,AMs)和肺部的单核细胞(Monocyte)会分泌大量促炎细胞因子和趋化因子,趋化中性粒细胞大量迁移,从而导致肺部炎症浸润。嗜酸性粒细胞(Eosinophil,Eos)既往被认为是寄生虫感染或过敏性疾病的效应细胞,近年来其在免疫调控中,尤其是适应性免疫反应中的作用不断被报道。在2011年有学者报道,存活的ARDS患者肺部Eos数量高于非存活的ARDS患者,提示Eos可能是ARDS发生中的保护因素。但是与此相反的是,哮喘患者虽然伴有肺部高Eos浸润,但往往对肺部感染疾病的敏感度更高。因此,Eos究竟在ALI或ARDS发生发展中起何种作用仍有待探索。组织定植细胞,如AMs,往往具有独特的表面标志物、功能和起源。本项目的研究发现,肺部定植有大量Eos,稳态下其数量远超外周血中Eos数量,和AMs数量级相同,但其是否存在特定来源或具有原位增殖能力尚无报道。在2016年,Mesnil等人发现HDM构建的Eos气道炎症模型中,SiglecF+CD125+Eos以CD101可以分为两个亚型,正式提出Eos分型的概念,但是不同亚型Eos在非Eos相关炎症中的作用有待探索。在本课题前期研究中,本团队发现雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)复合体的不同亚单位在Eos发育中存在不同调控作用,该项目具体工作已于2018年发表在Sci Rep。该课题的研究为本文所涉及的课题研究提供了实验方案和条件优化,尤其是Eos相关分离和培养的实验基础为本文Eos过继实验或骨髓培养提供了方法学支持。在本研究团队前期实验基础上,基于上述假设,实验室研究中我们利用野生型(Wild Type,WT)小鼠和Eos缺失的PHIL小鼠构建了 一系列嵌合体小鼠及LPS诱导的ALI模型,观察肺部Eos变化及来源,检测PHIL小鼠肺部炎症浸润,并在分析Eos分型的基础上,利用Eos气道过继、转录组高通量测序及脂类代谢产物分析等方法深入探究Eos与ALI之间的调控关系。临床方面,我们收集了健康人群、ARDS患者及哮喘患者的外周血进行分析,同时回顾性观察了 ARDS患者外周血Eos数量与转归的关系。目的明确不同亚型Eos在ALI发生中的调控作用,并进一步研究其机制。方法1.整体模型利用6-10周龄的WT小鼠,以LPS气道滴注建立经典的ALI模型,在炎症初期(0.5h-2h)以多色流式分析、刚果红染色及免疫组化等方法标记肺部Eos,观察其数量变化和分布位置;通过WT小鼠(CD45.2)与CD45.1WT小鼠、Eos缺失的PHIL小鼠相互骨髓移植,及Eos尾静脉回输等方法,观察肺部Eos的来源;在炎症初期(0.5h)和炎症极期(24h)分析LPS模型组WT和PHIL小鼠肺泡灌洗液(BALF)内中性粒细胞浸润及炎症因子分泌、肺部损伤情况及绘制生存曲线,明确Eos在ALI中的作用;对比鸡卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)诱导的过敏性气道炎症中Eos分型,观察ALI初期诱导的Eos是否存在分型差异,并通过气道过继实验明确不同亚型Eos在ALI初期功能差别。为了验证并拓宽本课题的结论,同时利用革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)构建WT和PHIL小鼠整体模型,观察肺部Eos数量变化和分型及肺部炎症反应。2.转录组测序及液相质谱色谱分子机制方面,利用流式细胞分选不同亚型Eos,并通过转录组测序筛选差别表达基因,并利用液相质谱色谱(Liquid chromatography/Mass spectrometry,LC/MS)探究其炎症相关脂类代谢产物分泌情况。3.临床标本采集和回顾性分析收集健康对照(志愿者)、ARDS患者及哮喘患者抗凝外周血,利用流式细胞术分析其Eos数量和CD101表型,证实小鼠模型中的结论。通过磁珠阳性富集的方法得到健康对照和哮喘患者外周血Eos,通过荧光定量聚合酶链式反应(Real time polymerase chain reaction,RT-PCR)及LC/MS分析探索正常人群和过敏性哮喘患者外周血Eos炎症相关代谢组学差别。回顾性观察涉及2012年-2018年在浙江大学医学院附属第二医院诊断为ARDS住院患者,通过分析其入院时24h内、出院前或死亡前24h内血常规Eos数量和最终转归,分析患者外周血Eos数量与生存的关系。结果1.LPS模型中,WT小鼠肺部在给药后出现Eos—过性增高,且Eos聚集先于中性粒细胞浸润。肺部增加的Eos位于肺实质内,肺泡灌洗无法得到。2.稳态下肺部Eos来源于骨髓,LPS暴露早期肺部增多的Eos由外周血募集而来。3.Eos缺失的PHIL小鼠在LPS暴露后,无论炎症初期和极期均表现为炎症的恶化、肺部损伤程度加深及更差的生存状态。4.相比于OVA模型CD101+Eos在小鼠肺部的大量浸润,LPS模型诱导主要为CD101-Eos在肺部浸润。5.CD101-Eos保护LPS诱导的ALI,但CD101+Eos促进ALI的发生。6.CD101-Eos较CDI01+Eos高表达Alox15,Eos是肺组织中Alox15表达的主要来源。机制方面,CD101-Eos可能通过Alox 15-Protectin D1保护LPS诱导的ALI。7.在金葡菌模型中,炎症初期诱导的也是CD101-Eos,PHIL小鼠模型组相比WT小鼠模型组表现为炎症浸润程度的加剧。8.哮喘患者外周血Eos中CD101表达较健康对照Eos高,且ARDS患者Eos中CD101表达与健康对照Eos并无明显差异。9.ARDS患者入院时外周血中Eos数量与健康对照并无明显差异,但存活的ARDS患者外周血Eos数量增高,而非存活ARDS患者外周血Eos数量不增高,进一步提示CDI0I-Eos对ALI发生发展中的保护作用。结论CD 101-Eos可以保护LPS诱导的ALI,该保护作用可能是通过Alox 15-Protectin D1分泌体现。