为研制更加安全高效的大肠杆菌疫苗,本研究以狐源致病性肺炎大肠杆菌HtrA蛋白为研究对象,克隆htra基因序列,构建原核表达载体,诱导表达重组蛋白His-HtrA,镍柱纯化重组蛋白,并检测其免疫保护力;利用Red同源重组技术成功构建大肠杆菌htra基因缺失株,研究htra基因与细菌生物学特性以及致病力之间的关系,为研究HtrA蛋白的致病机制和大肠杆菌基因工程疫苗提供参考。研究的具体内容与结果包括:1.大肠杆菌HtrA蛋白的原核表达及免疫保护力分析本研究根据NCBI GeneBank中公布的htra基因序列,设计引物克隆出大肠杆菌htra基因;构建pET-32a-htra表达载体,将重组载体转化入BL21大肠杆菌工程菌中,成功表达目的重组蛋白,大小约为65 kD,Western blot方法证明该蛋白具有较好的免疫原性。将纯化蛋白免疫小鼠,以2LD₅₀剂量的野生大肠杆菌攻毒,HtrA蛋白对小鼠的免疫保护力达到65%,结果表明HtrA蛋白具有作为疫苗的潜力。2.大肠杆菌htra基因缺失株的构建和基本特性研究为探究htra基因在大肠杆菌中的作用,利用Red同源重组技术构建htra基因缺失株,研究发现,大肠杆菌野生型和htra基因缺失株在生长速率和生化特性方面并没有明显差异。3.大肠杆菌htra基因缺失株生物学特性分析及毒力试验本研究从细菌运动能力、生物被膜形成能力、抗巨噬细胞吞噬能力、抵抗环境应激能力以及毒力等几方面对突变菌株进行评价,结果表明,htra基因缺失株的运动能力、生物被膜形成能力、抗吞噬细胞吞噬能力以及抵抗环境应激能力均有明显下降。检测htra基因缺失株的LD₅₀,结果显示缺失株的LD₅₀=3.55×10⁷CFU,野生型大肠杆菌的LD₅₀=5.01×10⁶ CFU,相差7倍,且缺失株引起的组织损伤较弱,说明htra基因缺失能够影响大肠杆菌毒力。