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核膜是细胞核的最外层结构,包括外层核膜、内层核膜、核孔复合体与核纤层。内层核膜上有许多特异的跨膜蛋白,被称为内核膜蛋白。内核膜蛋白通过与染色质、核纤层或其他蛋白的相互作用,在基因组装与稳定性、机械力传导、转录调控、信号传递、脂质代谢等方面有重要作用,部分内核膜蛋白的基因突变还会导致严重的遗传疾病。目前为止,组学鉴定到了30多种内核膜蛋白,但被深入研究的不到10种,大部分内核膜蛋白的功能与结构仍不明确。TMEM201（transmembrane protein 201）是一个由同名基因编码,666个氨基酸组成的五次跨膜的内核膜蛋白。TMEM201具有进化保守的结构域,在各组织中普遍表达,在特定的器官（例如脑、睾丸、卵巢）中表达丰度更高,提示着TMEM201的重要功能与生理意义。虽然一些组学研究检测到了TMEM201,但几乎没有对其功能和结构的直接、详细的报道,TMEM201在细胞活动、生理和病理过程中扮演的角色尚不明确。本论文主要围绕TMEM201在血管内皮细胞迁移与血管新生中的功能展开研究。血管新生是指从已有的血管网络发展形成新生血管的过程,血管内皮细胞的迁移是其中一个重要环节。我们首先在细胞水平考察了TMEM201对血管内皮细胞（endothelial cell,EC）迁移的作用:在原代人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）中建立sh RNA介导的TMEM201表达敲低体系,随后进行小室迁移和划痕实验;实验结果显示,TMEM201敲低使HUVEC的迁移速度减慢,迁移中的极性丢失,表现为细胞核及高尔基体重定位的紊乱;进一步考察发现TMEM201的敲低削弱了HUVEC的管腔形成和出芽能力,阻碍了细胞的血管新生能力。为了在整体动物水平验证TMEM201对血管新生的作用,我们构建了Tmem201基因敲除小鼠和tmem201基因敲除斑马鱼:考察发现Tmem201敲除导致新生鼠的视网膜血管发育迟缓,氧诱导视网膜病变模型中的血管增生得到缓解,基质胶栓模型中的血管浸润减少;在斑马鱼胚胎发育中,我们观察到tmem201敲除胚胎的体节间血管发育存在明显缺陷,显微注射m RNA回补TMEM201,可以逆转血管发育不良的表型。以上细胞与动物水平的结果显示,TMEM201具有促进EC迁移和血管新生的功能。在明确表型之后,我们开始研究TMEM201的作用机制。TMEM201的内核膜定位局限了其发挥功能的方式,而对它的结构和功能域的有限了解,使得TMEM201的作用机制较难突破。借鉴其他内核膜蛋白的研究认识,我们猜想TMEM201相互作用蛋白的挖掘,可能是其机制研究的突破口。因此,我们选用了高时间分辨率、高空间特异性的抗坏血酸过氧化物酶（enhanced ascorbate peroxidase 2,APEX2）介导的邻近标记技术,来筛选TMEM201的相互作用蛋白。经典的APEX2邻近标记法将APEX2和TMEM201直接融合,邻近标记后的质谱结果筛选到许多内质网与其他生物膜系统的蛋白,掩盖了TMEM201在内核膜上的相互作用。随后我们改进了方法——RAPID（rapamycin and APEX2dependent identification of proteins）邻近标记法将TMEM201与FRB（FKBPrapamycin-binding）结构域融合,APEX2与FKBP12（12-k Da FK506-binding protein）融合,同时通过核定位序列将APEX2的功能局限在核内。在雷帕霉素的作用下,FRB和FKBP12形成异源二聚体,进而APEX2融合蛋白被招募到TMEM201融合蛋白附近。邻近标记后的质谱结果特异地筛选到了TMEM201在核膜或核内的相互作用蛋白。与经典方法相比,改进的RAPID邻近标记法在研究TMEM201的相互作用中表现出更高的特异性,提示着TMEM201更为真实的互作与效应。在TMEM201的相互作用蛋白中,我们发现了LINC（linker of nucleoskeleton and cytoskeleton）复合物的元件。LINC复合物由内层核膜上的SUN结构域蛋白和外层核膜上的KASH结构域蛋白组成,分别连接核骨架与胞质骨架,通过传导机械力、牵引核移动等作用,在细胞迁移与极性的建立中发挥重要作用。通过免疫荧光和免疫共沉淀的方法,我们验证了HUVEC中TMEM201与LINC复合物元件SUN2,Lamin-A/C的相互作用,并鉴定发现TMEM201的N端介导了这种作用。截短实验中,当TMEM201缺少N端结构时,与LINC复合物的相互作用消失,无法促进HUVEC的迁移和管腔形成。斑马鱼模型中,我们同样观察到缺失N端的TMEM201截短无法逆转胚胎体节间血管发育异常的表型,而保留N端的其他截短和全长TMEM201一样,可以促使体节间血管发育恢复。以上结果提示TMEM201的N端结构是调控EC迁移和血管新生的必要区段,关于TMEM201与LINC复合物相互作用后,如何调控其功能的具体分子机制有待进一步研究。除了TMEM201在EC迁移与血管新生中的作用及机制研究外,本论文还基于Tmem201敲除小鼠不孕的表型,探索了TMEM201在雌性生殖和卵泡发育中的全新功能。首先我们发现Tmem201敲除雌鼠无法生育,且动情周期和部分性激素水平有所异常。与其他生殖和性腺器官相比,TMEM201在卵巢中高表达,因此我们考察了敲除鼠的卵巢功能。结果显示,TMEM201的缺失导致雌鼠的卵巢偏小、卵泡发育阻滞、排卵障碍。以上结果提示了TMEM201在卵泡发育和排卵维持中的重要作用,可能与TMEM201在卵母细胞中的高丰度表达相关。综上所述,我们围绕着新颖的内核膜蛋白TMEM201展开了研究。首先,本论文从TMEM201促进EC迁移的发现切入,验证了TMEM201在细胞水平和整体动物水平对血管新生的推动作用,最后具体到TMEM201与迁移中关键的LINC复合物的相互作用和功能区段;从细胞到动物,从表型到机制,我们首次发现并报道了TMEM201在EC迁移及血管新生中的功能与机制。其次,本论文首次将邻近标记技术应用于内核膜蛋白TMEM201的研究中,优化方法并验证了其在TMEM201相互作用筛选中的可行性。获得的TMEM201相互作用蛋白网络,不仅为相关研究提供了资源库和线索,也为其他内核膜蛋白的研究提供了参考。最后,本论文充分利用Tmem201敲除鼠的资源,首次提出TMEM201在卵巢中的表达分布,以及其在雌性生殖与卵泡发育中的作用,为后续研究提供了线索依据和实验基础。