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多甲氧基黄酮(PMFs,polymethoxylated flavones)是一类甲基化程度较高的黄酮类物质,几乎特异性地存在于柑橘属植物中,因其较高的生物活性受到广泛的关注。PMFs分子上的甲基多由O-甲基转移酶(OMT,O-methyltransferase)催化形成。鉴别柑橘果实中PMFs生物合成相关的基因OMT并验证其功能,对于解析柑橘PMFs的生物合成途径具有重要意义。瓯柑(Citrus reticulata cv.Suavissima)果实富含PMFs,本文以瓯柑果实为研究材料,开展柑橘PMFs生物合成相关基因OMT的鉴别与功能研究。主要结果如下:1.结合柑橘克里曼丁基因组和转录组,对OMT基因家族成员的系统进化、基因结构、蛋白结构及基因表达模式进行了分析。从柑橘克里曼丁基因组中共鉴别到64个OMT基因家族成员,根据氨基酸水平上的系统进化分析,可分为两个亚家族:咖啡酸O-甲基转移酶(COMT,caffeic acid O-methyltransferase)亚家族(57个)和咖啡酰辅酶A O-甲基转移酶(CCo AOMT,caffeoyl Co A O-methyltransferase)亚家族(7个)。两个亚家族成员之间的基因结构、蛋白结构域和结构模体差异较大,而亲缘关系密切的OMT成员则较为类似。转录组数据显示,OMT基因家族成员转录水平差异较大,且在不同发育阶段和UV-B处理条件下的瓯柑果实OMT基因表达模式不同。2.利用HPLC和LC-MS/MS对瓯柑果皮类黄酮单体进行了鉴定和代谢规律分析。在瓯柑果皮中共鉴定得到9种类黄酮,主要包括6种黄烷酮类糖苷和3种PMFs。果实发育过程中,黄烷酮类糖苷在油胞层和白皮层的含量均呈下降趋势,PMFs特异地积累在果实油胞层中,呈先上升后下降的趋势。UV-B处理对果皮中黄烷酮类糖苷的积累无明显影响,但可以显著增强PMFs的积累。3.相关性分析发现,在瓯柑不同发育阶段、不同组织及在UV-B处理条件下,CrOMT1基因的表达水平与柑橘中的PMFs含量呈正相关。CrOMT1(CCo AOMT亚家族成员)是第一个在柑橘中鉴定的与PMFs含量相关的候选基因。体外酶活分析显示,CrOMT1重组蛋白体外能够催化一系列具有邻羟基系统的类黄酮底物,且对黄酮类催化效率最高,偏好催化5,6,7,8,3’,4’-六羟基黄酮(PMF-type底物)类似物的6位、8位和3’位,但对3’催化活性较低,这种偏好性(特别是6位和8位)恰好与天然PMFs的甲基化位点相对应。在瓯柑果皮中进行瞬时过量表达分析,结果表明CrOMT1过表达增强了果皮中PMFs的积累。由此验证了CrOMT1具有调控PMFs合成的生物学功能。4.序列同源性分析发现,柑橘中的CrOMT2(COMT亚家族成员)与拟南芥黄酮醇3’-O-甲基转移酶(At OMT1)的氨基酸序列高度一致(一致度达73.35%)。在瓯柑不同发育阶段、不同组织中CrOMT2表达水平与PMFs含量呈正相关,但是UV-B处理则对基因表达无显著影响。体外酶活测定发现CrOMT2重组蛋白能够催化一系列具有邻羟基系统的类黄酮底物,且偏好催化PMF-type底物类似物的3’位,也对7位有一定的活性,能够解释天然PMFs中相应位点的甲基化。瓯柑果皮中瞬时过量表达CrOMT2后,PMFs含量显著增加。由此揭示了CrOMT2是另一个具有调控PMFs合成生物学功能的基因。