论文部分内容阅读
目的:构建腺病毒介导的人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因和端粒重复序列结合因子2(TRF2)基因的RNA干扰(RNAi)表达载体,探讨hTERT和TRF2蛋白在MCF-7细胞中表达的相关性,以及hTERT和TRF2双基因干扰对乳腺癌治疗的协同性,为联合干扰hTERT和TRF2基因作为肿瘤基因治疗新策略的应用提供实验依据。方法:设计针对hTERT和TRF2基因的RNA干扰靶序列,合成具有该靶序列短发夹结构的寡核苷酸,退火形成双链DNA,通过T4 DNA连接酶连接到线性化pGenesil-1质粒U6启动子下游,构建重组表达质粒pGenesil-shRNA-hTERT和pGenesil-shRNA -TRF2。随后将U6-hTERT-shRNA和U6-TRF2-shRNA表达框克隆到入门载体pENTRTM1A,再通过LR体外同源重组将表达框(U6-shRNA-hTERT、U6-shRNA-TRF2)转移至pAd/PL-DEST腺病毒表达质粒上,并在HEK293细胞内包装为具有感染能力的病毒颗粒rAd-hTERT和rAd-TRF2。同法构建不针对任何基因的shRNA阴性对照rAd-HK,空病毒对照rAd-blank和表达绿色荧光蛋白(EGFP)的腺病毒rAd -EGFP。培养MCF-7细胞,接种指数生长期细胞于6孔板,转染rAd–EGFP以测定最佳感染强度和最佳感染时间。然后设置空白组、空病毒组、阴性对照组、rAd-hTERT组、rAd-TRF2组、rAd-hTERT/rAd-TRF2联合组,分别以50MOI转染人乳腺癌MCF-7细胞。于转染后48h裂解各组细胞提取总蛋白,通过western blot检测各组hTERT和TRF2蛋白的相对表达量。同时于转染后1~6d用MTT法检测细胞增殖情况;PI染色后流式细胞仪检测转染48h后细胞周期分布情况。结果:①重组质粒pGenesil-shRNA-hTERT和pGenesil-shRNA-TRF2经Xbal酶切鉴定和测序鉴定证实目的序列已准确插入到预计位点,重组质粒构建成功。②重组腺病毒rAd-hTERT和rAd-TRF2经酶切鉴定和PCR鉴定证实包装成功。③以50MOI转染rAd–EGFP于MCF-7细胞后48h荧光显微镜下观察,转染效率达99%左右。④免疫印迹分析显示: rAd-hTERT组和rAd-hTERT/rAd-TRF2联合组hTERT蛋白的相对表达量与其它四组相比均下降82%左右,而rAd-hTERT组与rAd-hTERT/rAd-TRF2联合组之间hTERT蛋白表达差异无显著性( P>0.05 ); rAd-TRF2组和rAd-hTERT/rAd-TRF2联合组TRF2蛋白的相对表达量与其它四组相比均下降83%左右,而rAd-TRF2组与rAd-hTERT/rAd-TRF2联合组之间TRF2蛋白表达差异无显著性(P>0.05)。⑤MTT实验结果显示:rAd-hTERT组、rAd-TRF2组以及rAd-hTERT/rAd-TRF2联合组在1～6d范围内细胞生长速度减慢、增殖显著抑制;但rAd-hTERT/rAd-TRF2联合组对MCF-7细胞增殖的抑制作用明显强于rAd-hTERT组和rAd-TRF2组,且细胞增殖抑制高峰持续时间明显长于rAd-hTERT组和rAd-TRF2组。⑥通过流式细胞仪检测细胞周期分布显示: rAd-hTERT组、rAd-TRF2组以及rAd-hTERT/ rAd-TRF2联合组于转染后48h,MCF-7细胞周期阻滞于G0/G1期、增殖指数(PI)显著下降;其中rAd-hTERT/rAd-TRF2联合组比rAd-hTERT组和rAd-TRF2组细胞周期阻滞更显著、细胞增殖指数(PI)下降更明显。结论:①成功构建了腺病毒介导的靶向hTERT和TRF2基因的RNA干扰真核表达载体rAd-hTERT、rAd-TRF2。②针对hTERT和TRF2基因的RNAi靶序列设计有效,将rAd-hTERT和rAd-TRF2转染人乳腺癌MCF-7细胞48h后可显著抑制hTERT蛋白和TRF2蛋白表达,但hTERT蛋白和TRF2蛋白表达无相关性。③单独转染rAd-hTERT和rAd-TRF2于人乳腺癌MCF-7细胞后细胞周期阻滞于G0/G1期、细胞增殖抑制,但联合转染rAd-hTERT和rAd-TRF2后细胞增殖抑制更明显、持续时间更长,说明联合干扰hTERT和TRF2基因可获得更有效的肿瘤基因治疗效果。