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背景:乳腺癌是亚洲乃至全球女性群体中最为常见的恶性肿瘤,尽管近年来随着医疗影像学技术的发展及患者自我健康监测意识的提高,通过早期诊断、早期手术切除或新辅助治疗等手段提高了一部分患者的生存率,其复发和转移仍然严重影响着患者的生命健康。因此,深入探究乳腺癌发生发展机制,寻求更为有效的诊断及预后指标尤为重要。乳腺癌中,肿瘤侵袭、复发与转移是影响患者预后的主要因素,这些过程与上皮-间充质转化的异常激活有关。上皮-间充质转化是指通过一系列因子的调节,上皮细胞的细胞连接减少、细胞极性消失,转化为具有间充质表型细胞的生物学过程,这一过程会导致肿瘤细胞获得迁移及侵袭能力,从而具有恶性生物学行为。其特征为细胞的上皮细胞标志物如E-cadherin、Laminin、Claudin-1和细胞角蛋白表达的缺失,取而代之的是间充质细胞标志物如N-cadherin、Vimentin表达增加。上皮-间充质转化可使细胞发生凋亡抵抗,导致肿瘤对放化疗耐受,也可以促进肿瘤的复发及远处转移。在侵袭性乳腺癌中,其标志物也越来越确切地与患者的预后相关。许多研究表明,肿瘤的上皮-间充质转化过程受到长链非编码RNA的调控。长链非编码RNA隶属于非编码RNA,它们总长度大于200个核苷酸,多数情况下不翻译多肽,往往以表观遗传调控、转录水平调控或转录后水平调控等多种方式参与编码基因的调控过程。目前已明确有多种长链非编码RNA会影响到肿瘤细胞的增殖、迁移等恶性生物学行为,与疾病的进程紧密相关。因此,它们被认为是基因表达和肿瘤发生发展的重要调节剂,也是肿瘤早期诊断、辅助治疗和判断预后的潜在靶标。在乳腺癌中,同样有许多长链非编码被证实存在着差异性表达,并对细胞的的生物学功能有着纷繁复杂的影响。在这之中,一些长链非编码RNA可以作为信号分子或通过表观遗传等方式直接作用于上皮-间充质转化相关基因,从而影响肿瘤细胞的侵袭及转移能力;一些可以通过细胞内精确的信号转导通路如TGF-β、Wnt/β-catenin及PI3K/AKT等间接调控上皮-间充质转化的发生;此外,一些长链非编码RNA可以通过竞争性内源RNA机制间接调控上皮-间充质转化的过程。竞争性内源RNA机制是近几年来备受关注的基因表达调控机制,基于共享微小RNA结合位点的转录本可以竞争性结合相同的微小RNA这一原理,如长链非编码RNA可以作为分子海绵吸附微小RNA,竞争性抑制微小RNA对靶基因的作用,进而在肿瘤发生、侵袭、转移和耐药性中发挥关键作用。本研究旨在发现乳腺癌中显著差异表达并对疾病进展及预后有显著影响的长链非编码RNA,深入探索其影响细胞恶性表型及肿瘤进展的具体机制,并对其在体内环境中的作用进行评估,为乳腺癌的诊断、预后判断及治疗提供新的依据。方法:第一部分:1.差异表达lncRNA的选定:通过生信分析筛选出在乳腺癌中显著高表达的几种lncRNA;取少量样本,q RT-PCR测定选定的几种lncRNA linc00504、linc00467、linc01094、linc00665在乳腺癌组织及细胞系中的表达情况,验证生信分析的结果。2.LncRNA基本特征的探究:在线预测选定lncRNA-linc00504的亚细胞定位,根据定位推测其发挥作用的可能的分子机制;在线数据库预测其与患者预后的相关性,并将其表达量与收集的临床病理信息作相关性分析;在线数据库预测其与乳腺癌分子分型的相关性,q RT-PCR测定其在四种分子分型的乳腺癌中的表达情况。3.LncRNA对细胞生物学功能的影响:构建过表达及沉默linc00504的稳转细胞系,分别进行过表达及沉默linc00504的细胞功能实验:CCK-8实验、划痕愈合实验（Wound Healing Assay）测定细胞的增殖活性及迁移能力,Transwell实验检测细胞的穿膜（侵袭）能力,Annexin V-FITC检测其对细胞凋亡的影响,Western Blot检测上皮-间充质转化标志物的蛋白表达。第二部分:1.差异表达基因的选定:通过生信分析筛选出在乳腺癌中显著高表达的基因,通过q RT-PCR验证生信分析的结果。2.靶基因在乳腺癌中的表达验证:q RT-PCR测定选定的基因MDM2在乳腺癌组织及细胞系中的表达情况,并测定其在四种分子分型的乳腺癌中的表达情况;Western Blot及免疫组织化学染色检测选定基因在蛋白水平的表达,荧光原位杂交检测选定基因在基因水平的改变;在线数据库预测选定基因与患者预后的相关性,并将其表达量与收集的临床病理信息作相关性分析。3.共同互作的靶miRNA的选定:查找linc00504与MDM2的序列,在线预测可以与二者互作的miRNA并将结果取交集;通过q RT-PCR验证生信分析的结果,初步选择符合条件的miRNA-miR-1244,构建出完整的ceRNA机制轴。4.miR-1244基本特征的探究:q RT-PCR测定miR-1244在乳腺癌组织及细胞系中的表达情况,并测定其在四种分子分型的乳腺癌中的表达情况;将miRNA表达量与收集的临床病理信息作相关性分析。5.互作关系的验证:构建双荧光素酶报告基因,验证linc00504-miR-1244及miR-1244-MDM2之间存在互作关系;通过RNA结合蛋白免疫沉淀及RNA pull down实验证实互作关系。6.LncRNA对miRNA的调控作用验证及通过调控miRNA对细胞生物学功能的影响:q RT-PCR测定过表达或沉默linc00504后miR-1244的变化,验证lncRNA对miRNA的调控;通过分组设计细胞功能实验及功能回复实验,进行CCK-8实验、Wound Healing划痕愈合实验、Transwell实验验证linc00504通过吸附miR-1244对细胞生物学功能的调控作用。7.LncRNA/miRNA轴对靶基因的调控作用验证及通过调控靶基因对细胞生物学功能的影响:再次通过分组设计细胞功能实验及功能回复实验,进行CCK-8实验、划痕愈合实验、Transwell实验验证linc00504/miR-1244通过调控靶基因对细胞生物学功能起着调控作用。8.ceRNA轴在体内的功能验证:将稳转细胞注入裸鼠构建裸鼠皮下移植瘤模型,测定成瘤大小,并制作组织切片通过免疫组织化学染色检测上皮-间充质转化各指标的表达。结果:第一部分:1.差异表达lncRNA的选定:基于TCGA数据库的生信分析结果显示,共有510个lncRNA在乳腺癌中显著上调,选择6对乳腺癌及癌旁配对样本,通过q RT-PCR对预测到的其中4种lncRNA进行检测,显示在所有lncRNA中linc00504在乳腺癌中上调最为显著,由此选定linc00504作为研究对象。2.Linc00504基本特征的探究:首先通过其编码序列预测到其定位于细胞质,推测可能通过竞争性内源RNA机制发挥作用;进一步选择40对乳腺癌及癌旁配对样本,通过q RT-PCR确定了linc00504在乳腺癌中高表达;GEPIA在线预后分析显示linc00504对晚期/进展期乳腺癌的预后有显著影响;结合40例患者的临床病理资料进行Spearman相关性分析,结果显示linc00504的表达与患者年龄、组织学分级、临床分期及ER的表达呈正相关,同样说明了其与患者预后存在相关性;GEPIA在线相关性分析显示linc00504同乳腺癌分子分型相关基因显著相关,进一步通过q RT-PCR测定linc00504在四种分子分型乳腺癌中表达的异同,发现linc00504在Luminal A型乳腺癌中的上调最为显著。3.Linc00504对细胞生物学功能的影响:构建ov-linc00504及si-linc00504稳转细胞系,验证转染效率后分组进行多种细胞功能实验;CCK-8增殖实验显示si-linc00504组细胞增殖活性下降,ov-linc00504组细胞增殖活性上升;划痕愈合实验显示si-linc00504组细胞迁移能力下降,ov-linc00504组细胞迁移能力上升;Transwell实验显示si-linc00504组细胞侵袭力下降,ov-linc00504组细胞侵袭力上升;Annexin V-FITC细胞凋亡实验显示si-linc00504组促进细胞早期凋亡,ov-linc00504组抑制细胞早期凋亡;q RT-PCR及Western Blot分析显示si-linc00504组细胞上皮指标的表达增加,间质指标表达减少,ov-linc00504呈现相反的趋势,说明linc00504能够促进细胞的增殖、侵袭、迁移,抑制细胞凋亡,促进上皮间充质转化过程。第二部分:1.差异表达基因的选定:基于TCGA数据库的生信分析结果显示,共有388个基因在乳腺癌中显著上调,经二次验证后选定上调最显著的基因MDM2。2.MDM2在乳腺癌中的表达验证:选择40对乳腺癌及癌旁配对样本,通过q RT-PCR确定了MDM2在乳腺癌中高表达;选取代表不同分子分型的细胞系,q RT-PCR及Western Blot验证MDM2在Luminal A型乳腺癌中的上调最为显著;选取40例组织切片免疫组化染色,证明MDM2在Luminal A型乳腺癌中高表达;同样来源的石蜡切片进行荧光原位杂交,证明MDM2在Luminal A型乳腺癌中存在着基因扩增;GEPIA相关性分析显示MDM2同乳腺癌预后基因显著相关,进一步通过免疫组化证实其表达与预后指标Ki-67、p53及Bcl-2的表达均显著相关;结合40例患者的临床病理资料进行Spearman相关性分析,结果显示MDM2的表达与患者年龄、ER、p53、ki-67、PD-1及PD-L1的表达呈正相关,其与年龄、激素受体、增殖指标及免疫相关受体存在相关性,同样说明了MDM2与患者预后存在相关性;3.共同互作的靶miRNA的选定:基于在线靶结合位点数据库的数据处理,找到可以同时与linc00504与MDM2互作的9个miRNA;选择3对乳腺癌及癌旁配对样本,通过q RT-PCR对预测到的4种miRNA进行检测,显示在所有miRNA中miR-1244在乳腺癌中下调最为显著;由此选定miR-1244作为研究对象。4.miR-1244基本特征的探究:选择40对乳腺癌及癌旁配对样本,通过q RT-PCR确定了miR-1244在乳腺癌中低表达;选取代表不同分子分型的细胞系,q RT-PCR结果显示miR-1244在Luminal A型乳腺癌中的下调最为显著;结合40例患者的临床病理指标统计结果进行Spearman相关性分析,结果显示miR-1244的表达与ER及PD-L1的表达呈负相关;5.互作关系的验证:通过双荧光素酶报告基因实验初步验证miR-1244可以与linc00504及MDM2的mRNA互作;通过RNA结合蛋白免疫共沉淀及RNA pull down实验进一步明确了它们的互作关系;6.Linc00504通过调控miR-1244对细胞生物学功能的影响:构建ov-linc00504及si-linc00504稳转细胞系,q RT-PCR结果显示ov-linc00504组miR-1244的含量显著下降;设计si-NC、miR-1244 inhibitor及si-linc00504+miR-1244 inhibitor三组进行细胞功能及功能回复实验,CCK-8实验结果显示linc00504通过作用于miR-1244促进细胞增殖,划痕愈合实验显示linc00504通过作用于miR-1244促进细胞迁移,Transwell实验显示linc00504通过作用于miR-1244促进细胞侵袭。7.Linc00504/miR-1244轴通过调控MDM2对细胞生物学功能的影响:构设计si-NC、si-linc00504及si-linc00504+ov-MDM2三组进行细胞功能及功能回复实验,CCK-8实验结果显示沉默linc00504后过表达MDM2会使原本减弱的细胞增殖活性有所回升,说明linc00504/miR-1244轴通过调控MDM2促进细胞增殖,划痕愈合实验及Transwell实验结果同样证实了linc00504/miR-1244轴通过调控MDM2促进细胞迁移及侵袭。8.Linc00504/miR-1244/MDM2轴在体内的功能验证:裸鼠皮下成瘤实验显示si-linc00504组成瘤体积明显缩小,而si-linc00504+ov-MDM2组成瘤体积有所增加,且si-linc00504组的移植瘤组织中上皮指标表达增加、间质指标表达减少,si-linc00504+ov-MDM2组上皮指标达降低、间质指标表达增加,说明linc00504/miR-1244/MDM2在体内同样可以发挥调控作用并促进上皮间充质转化。结论:1.Linc00504在乳腺癌中高表达,其表达具有分子分型上的特异性并与患者预后相关;2.Linc00504可以促进乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭等恶性表型并促进上皮间充质转化;3.Linc00504可以发挥分子海绵作用吸附miR-1244,并竞争性抑制miR-1244同MDM2的结合;4.Linc00504可以通过linc00504/miR-1244/MDM2轴促进细胞的增殖、迁移、侵袭等恶性表型;5.Linc00504可以通过linc00504/miR-1244/MDM2轴促进细胞的恶性生物学行为、促进上皮-间充质转化过程,并促进乳腺癌的进展。