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目的人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)是一种双链闭合的小DNA病毒,特异性很强,人是其唯一宿主。一般来说,E5基因和高危型HPV的致癌机制之间具有特定联系。目前有关HPV的研究大多都是关于其主要致癌基因E6和E7的,而针对单一E5基因的研究则比较少见。本实验将HPV16 E5和构建的E5缺失突变体转染人口腔永生化上皮细胞,然后对宿主细胞的细胞形态,细胞增殖及E6、E7基因mRNA表达水平进行了分析,所得结果将为深入研究E5基因对人永生化口腔上皮细胞的影响及其与E6和E7基因之间的相互作用提供理论基础。方法(1)E5基因缺失突变体基因表达载体的构建:分析高危型HPV16 E5全序列及其分子结构,设计带有1对酶切位点(Hind III,BamH I)的HPV E5系列缺失突变体引物,分别克隆1-69 bp、1-171 bp、70-249bp、172-249 bp 4个片段,构建HPV16 E5系列缺失突变体, PCR扩增,回收DNA片段,获得E5缺失突变体基因片段;将E5缺失突变体基因片段连接到质粒pLEGFP-N1,构建pLEGFP-ΔE51、ΔE52、ΔE53、ΔE54,双酶切后送测序鉴定。(2)利用PA317包装细胞系将各基因包装成逆转录病毒。(3)E5及其各缺失突变体转染人永生化口腔上皮细胞,利用RT-PCR、Real-time PCR等方法确认E5是否成功表达以及对E6和E7基因mRNA表达有无影响。(4)MTT法检测HPV16 E5基因对宿主细胞增殖的影响。结果(1)构建HPV16 E5基因的缺失突变体表达载体pLEGFP-ΔE51、ΔE52、ΔE53、ΔE54。酶切和测序结果表明,各缺失突变体正确插入到载体的多克隆位点内。(2)将pLEGFP- E5、ΔE51、ΔE52、ΔE53、ΔE54转染PA317包装细胞,获得的可以转染宿主细胞的重组质粒。(3)将HPV16型E5及其缺失突变体转染入人永生化口腔上皮细胞内,经RT-PCR验证各个目的基因均能够表达,转染后细胞的增殖实验和Real-Time PCR表明:HPV16 E5基因能够促进宿主细胞增殖(P<0.05),并且能够间接上调HIECO中E6和E7的mRNA表达水平,而其缺失突变体对宿主细胞增殖以及E6和E7表达水平无明显影响。结论HPV16型E5基因在一定程度上促进人永生化口腔上皮细胞增殖,并对E6和E7基因mRNA表达有一定的间接调控作用。