论文部分内容阅读
α-半乳糖苷酶(α-galactosidase,α-D-galactoside galactohydrolase; EC 3.2.1.22)也称蜜二糖酶,是一种外切糖苷酶。催化移除不同底物中α-连接的末端非还原性D-半乳糖。α-半乳糖苷酶广泛存在于动物、植物、微生物中。而微生物种类繁多、分布广泛、适应性强,因此是α-半乳糖苷酶的主要来源。α-半乳糖苷酶按其氨基酸序列的相似性被分类到糖苷水解酶(GH, glycoside hydrolase )的第4、27、36和57家族。27和36家族是该酶的主要来源,其中27家族α-半乳糖苷酶主要来源于真核,36家族α-半乳糖苷酶主要来源于原核。α-半乳糖苷酶在医疗、食品、化工及饲料等方面有着广泛的应用。目前α-半乳糖苷酶研究中存在的问题一是性质优良的α-半乳糖苷酶发现,另一个是α-半乳糖苷酶的高效表达及规模化的生产,以解决应用中的一系列问题。本研究利用生物信息学方法,通过对来源广泛的36家族的α-半乳糖苷酶序列进行比对和分析,确定36家族分子量在70-80kDa的α-半乳糖苷酶蛋白序列保守基序为D-D-G-W和E-P-E-M,设计简并引物,通过简并PCR扩增得到Pedobacter sp. MJ11的基因片段,通过两步TAIL-PCR方法拿到基因全长。来源于Pedobacter sp. MJ11的α-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中异源表达,并验证其基因功能,酶纯化后进行了详细的酶学性质研究。来源于Pedobacter sp. MJ11的α-半乳糖苷酶基因,由2166个碱基编码721个氨基酸和一个终止密码子。该基因属于糖苷水解酶36家族,氨基酸序列和已报道的来源于Bacteroides thetaiotaomicron的α-半乳糖苷酶有最高相似性为54%,因此该酶基因具有很高的新颖性。重组酶Aga-MJ11-H蛋白理论分子量约80 kDa,该蛋白经过中国科学院动物研究所质谱检测中心MALDI-TOF-MS及LC-ESI-MS/MS做进一步检测正确。重组酶Aga-MJ11-H的最适温度是40℃,最适pH为5.5。该酶的PH稳定性在4.0-10.0之间。重组酶Aga-MJ11-H对低聚糖如蜜二糖、水苏糖和棉子糖进行了水解实验,对这三种底物均有一定的水解能力。以pNPG为底物测得Km是2.94mM,以蜜二糖为底物测得Km是22.37mM。重组酶Aga-MJ11-H对蛋白酶K、枯草杆菌蛋白酶和α-糜蛋白酶有很好的蛋白酶抗性,将来可能在饲料添加剂方面有一定的应用前景。就目前研究而言,该酶是糖苷水解酶36家族里,来源于Pedobacter sp.的第一个做基因功能验证的酶。