核酸适配体介导的FRET探针构建及靶向识别效应研究

来源 :山西师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ceolq
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实现食品安全及疾病相关生物分子的靶向识别及检测是食品安全控制与疾病精准诊断的首要前提。核酸适配体因易于合成修饰,对靶标具备高度专一亲和识别性能而成为生物分子靶向识别的一种理想载体;量子点、氧化石墨烯等新型纳米光学材料的出现为各种生物识别传感探针的构建提供了全新信号转换基底;基于荧光物质之间纳米尺度距离变化响应的非辐射荧光共振能量转移(FRET)机制为生物分子间靶向识别效应传感及探针构建提供了一种有效模式。论文围绕以提高探针靶向性与灵敏性从而实现与食品安全和疾病诊断密切相关的生物分子的精准检测为目标,基于FRET机制,借助核酸适配体对靶标分子的靶向识别性能,以量子点、氧化石墨烯为能量供受体对,通过对能量供受体对的修饰组装,并以核酸适配体作为能量供受体对之间信号响应调节的关键介导,构建了四种核酸适配体介导的FRET探针,主要内容如下:1.针对细菌内毒素(脂多糖)对食品安全及人体健康的潜在危害及快速检测细菌内毒素的现实需求,采用6-羧基罗丹明标记的脂多糖适配体作为荧光靶向探针,氧化石墨烯作为荧光猝灭剂,基于脂多糖适配体对脂多糖的特异识别性能和氧化石墨烯的荧光猝灭性能,构建了一种可简单、快速靶向识别脂多糖的FRET探针,在优化的实验条件下,所构建的探针对脂多糖具有良好的检测性能,线性范围为25–1600 ng mL-1,检出限为15.7 ng mL-1,可用于果汁、啤酒等饮料中脂多糖含量的定量检测,具备一定的实际应用性能。2.借助量子点优越的光学性能、核酸适配体对目标分子的靶向识别性能及氧化石墨烯的荧光猝灭性能,针对胰岛素常规检测方法操作过程繁琐的不足,构建了一种适配体介导的量子点/氧化石墨烯复合FRET探针,在适配体介导下,胰岛素适配体修饰的量子点可有效吸附于氧化石墨烯表面,量子点荧光被氧化石墨烯猝灭,体系中存在胰岛素时,由于适配体与胰岛素的高亲和识别作用将导致适配体空间构象发生改变,阻止适配体修饰的量子点与氧化石墨烯的有效结合并实现其荧光恢复,在最优实验条件下,所构建探针对胰岛素的检测线性范围为4.3-206.4 nM,检出限为2.74 nM,适用用于医药制剂中胰岛素含量的快速标定,且检测过程操作简单、便捷。3.在通过量子点/氧化石墨烯构建FRET探针实现单一目标物检测的基础上,基于量子点多色荧光性质及氧化石墨烯广谱的荧光猝灭性能可构建多组分生物分子同步检测探针为可能,以实现甲肝、乙肝、丙肝三种肝炎病毒核酸同步检测为目标,采用甲肝、乙肝、丙肝三种病毒核酸互补配体为修饰剂,分别对三种同源激发、发射波长不同的CdSe/ZnS QDs量子点(发射波长分别为525nm,585nm和632nm)进行了修饰,获得了三种核酸配体修饰量子点并作为荧光能量供体,同时以氧化石墨烯为荧光能量受体,通过核酸配体与目标核酸序列靶向识别作用的介导实现了量子点与氧化石墨烯之间的能量转移,实现了三种肝炎标志物的同步检测,构建的探针为肝炎病毒的快速诊断和分型提供了新思路,也为基于多色量子点实现多组分生物分子的同步检测提供了点滴借鉴。4.基于能量供受体的光学性质对FRET探针的检测性能的影响,以提高氧化石墨烯的荧光猝灭性能从而增强FRET探针的信号转导效率,并进一步构建高灵敏FRET探针为目标,在对氧化石墨烯羧基功能化的基础上,选择黑洞荧光猝灭剂BHQ-2为修饰剂,通过共价缩合将BHQ-2交联于羧基化氧化石墨烯表面,制备了一种BHQ-2修饰的氧化石墨烯复合荧光猝灭剂(GO@BHQ-2);BHQ-2修饰的氧化石墨烯作为一种双重能量受体可高效的猝灭量子点的荧光,相对于单纯的氧化石墨烯而言,GO@BHQ-2对量子点的荧光猝灭效率可提高2.4倍,从而可作为一种荧光超猝灭剂用于荧光探针的构建;在此基础上进一步以蓖麻毒素(RTB)适配体修饰的量子点为荧光供体,GO@BHQ-2为荧光受体,以适配体为介导,构建了一种检测蓖麻毒素的FRET探针,检测蓖麻毒素的线性范围为0.05-3.0μg mL-1,检出限为0.037μg mL-1;通过标准加样回收实验证实所构建的探针可用于实际样品中RTB选择性检测,从而为RTB的快速检测提供一种新的技术方法,也为氧化石墨烯改性修饰提供了一定的思路。总之,本文以荧光能量共振转移为靶向识别探针构建原理,以适配体功能化量子点、氧化石墨烯为能量供受体对,基于核酸适配体对目标分子的靶向识别性能及与氧化石墨烯的独特吸附性能,通过适配体介导调节能量供受体对之间的荧光能量转移效率,构建了与食品安全和疾病诊断密切相关生物分子的FRET探针,为基于功能化量子点及改性氧化石墨烯等构建靶向识别荧光探针提供了一定的依据。
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