ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)是淀粉生物合成中的关键酶,由成对的两个大亚基(AGPL)和成对的两个小亚基(AGPS)组成的异源四聚体,分为胞质型和质体型两种,因此,在植物细胞内存在四类AGPase亚基:AGPase胞质型大亚基(AGPL1)、胞质型小亚基(AGPS1)、质体型大亚基(AGPL2)和质体型小亚基(AGPS2)。课题组前期研究结果表明,小麦淀粉合成基因TaAGPL1的过表达能显著提高小麦籽粒AGPase活性和淀粉积累速率,从而证明了它在小麦籽粒淀粉合成中的重要作用。本研究运用酵母单杂交技术,通过将TaAGPL1 promoter与小麦籽粒cDNA文库进行酵母单杂交,筛选出控制TaAGPL1基因表达的上游调控因子,并利用大麦条纹花叶病毒诱导的基因沉默(BSMV-VIGS)技术对调控因子进行功能研究,从而探究了调控TaAGPL1基因表达的分子机制。主要结果如下:(1)运用酵母单杂交技术筛选出控制TaAGPL1表达的两个调控因子(TabHLH39转录因子和TaPDIL1-2分子伴侣)。分离出TabHLH39基因的cDNA序列,它编码了486个氨基酸,蛋白序列包含了bHLH家族所共有的四个经典结构域。通过烟草瞬时转化和酵母自激活试验,发现TabHLH39仅定位于细胞核且具有转录自激活活性。利用小麦基因组数据库搜索获得TaPDIL1-2基因定位于4BS,其ORF编码了512个氨基酸,蛋白序列包含有四个经典的硫氧还蛋白结构域。(2)田间利用BSMV-VIGS沉默技术研究了TabHLH39基因的功能。构建BSMV-VIGS-TabHLH39沉默载体并对其进行线性化、纯化和体外转录,成功后用于接种田间灌浆期的小麦穗部。结果显示,在花后19 d、24 d、29 d和34 d,BSMV-VIGS-TabHLH39沉默植株中TabHLH39基因表达量显著降低(94.6~98.7%);BSMV-VIGS-TabHLH39沉默植株成熟籽粒中粒长、粒宽、粒重及淀粉含量均显著降低(降幅为10.1%、11.7%、3.7%和8.8%);对接种后14 d、19 d、24 d、29 d和34 d的小麦籽粒进行qPCR检测,发现BSMV-TabHLH39沉默植株籽粒内TaAGPL1的表达量也均显著下降。这些结果表明TabHLH39可能通过正向调控淀粉合成基因TaAGPL1的表达,进而参与了小麦籽粒淀粉的合成。(3)田间利用BSMV-VIGS沉默技术研究了TaPDIL1-2基因的功能。构建BSMV-VIGS-TaPDIL1-2沉默载体并对其进行线性化、纯化和体外转录,成功后用于接种田间灌浆期的小麦穗部,并对成功沉默的小麦植株籽粒进行定量检测,结果显示BSMV-VIGS-TaPDIL1-2沉默植株成熟籽粒中粒长、粒宽、粒重和淀粉含量均显著上升(升幅为3.8%、5.7%、6.8%和1.9%);且BSMV-TaPDIL1-2沉默植株籽粒内TaAGPL1的表达量均显著上升。因此推测作为参与氧化蛋白质正确折叠的重要伴侣蛋白TaPDIL1-2,它能够确保一些转录因子(C2H2-ZFS和AP2/ERF等)的正确折叠,从而间接和负向调控TaAGPL1基因的表达并在淀粉生物合成中起重要作用。