论文部分内容阅读
人甲状旁腺激素（hPTH）是甲状旁腺分泌的多肽激素，由84个氨基酸组成。它能与骨基质和肾细胞膜上专一性的受体结合，将调节细胞中钙磷浓度的信号传导到膜内。hPTH活性片段在N端，其氨基末端的34肽是能表现PTH全部活性的最小片段。PTH及其活性片段在治疗骨及肌肉疾病方面有重要作用。由于PTH的大量提取及化学合成有难度，因此采用基因工程技术研发hPTH及类似物是近几年基因工程重组药物的热点。本文在人工合成的hPTH（1-34）基因上游加入了编码专一性蛋白水解酶Factor Xa识别位点的序列，将其插入表达载体pET-32a中，再转化入大肠杆菌BL21（DE3），成功构建了PTH-32a／BL21（DE3）工程菌。经诱导表达得到融合于硫氧还原蛋白、组氨酸标签羧基端的rhPTH（1-34）融合蛋白，表达量占菌体总蛋白的55％，以可溶形式存在。超声破菌后的上清通过His-Bind column纯化后，经Factor Xa裂解释放出rhPTH（1-34），再次过His-Bind column将rhPTH（1-34）与其它组分分离，可得到电泳纯的rhPTH（1-34）。1L发酵液可以得到4mg左右电泳纯的PTH（1-34）蛋白。用此种方法制备rhPTH（1-34），步骤简单，条件温和，成本低，纯度较高，产物序列与野生型完全一致。心脑血管系统疾病己经成为威胁人类健康的重要杀手，其中急性心肌梗塞（AMI）位于一些西方发达国家死亡疾病之首。血栓形成是该类疾病的一个重要诱因，溶栓疗法是其治疗的最主要手段。在溶栓治疗过程中，为防止溶栓后再栓塞的发生，溶栓和抗凝药物联合应用是临床治疗血栓相关性疾病的重要给药方案。溶栓药物瑞替普酶（reteplase，r-PA）是人组织纤溶酶原激活剂（t-PA）的缺失变异体，它是在t-PA分子原结构的基础上，删除了其中的kringleI、Finger、EGF 3个结构域，只保留了t-PA分子中的kringle II及蛋白酶2个功能区（176-527位氨基酸）及N端的1～3个氨基酸，为单链非糖基化蛋白，由355个氨基酸组成，分子量为39 kDa，含有9对二硫键，为第三代溶栓药物。r-PA起效快，药效强，出血等副作用小。且用大肠杆菌表达，成本比t-PA明显降低：因半衰期延长等原因，其临床治疗剂量比野生型减少，静脉用药10min内完成，比野生型快9倍，因此使用方便，易于推广。r—PA已经上市，竞争力很强，是一种很有前途的新型溶栓药物。尽管溶栓药物能够降低患者的死亡率，但临床实验结果表明目前的溶栓药物效果还不太理想。即使是被认为溶栓效果较好的r-PA，也只有70%的患者在用药后90min后恢复了血流的再通。而且，部分患者还会在溶栓后发生再栓塞和出血等并发症。当药物溶栓时，纤溶系统被激活，凝血系统也同时被激活。在这一过程中，通过激活接触因子和V因子，能产生大量结合凝血酶。而凝血酶在血液凝固过程及血小板激活过程中具有双重作用，被激活后能够放大凝血效应，刺激新血栓的形成。因此，在血栓性疾病的治疗中，为了增强溶栓效果和防止溶栓后再栓塞的发生，在使用溶栓药物的同时，往往还使用抗凝药物。这对抑制凝血酶阻断其激活作用具有重要意义。子量为7K Da。与肝素相比，水蛭素具有以下优点：（1）水蛭素的抗凝作用不依赖于抗凝血酶III，可以节约这种天然抗凝剂，并可在缺乏抗凝血酶III的病人中使用（2）水蛭素不与抗肝素的蛋白结合，如因子IV（3）水蛭素有效浓度比肝素低（4）水蛭素可以抑制流动相中和结合于血栓上的的凝血酶，而肝素仅能够灭活流动相的中凝血酶活性（5）水蛭素用于抗栓治疗，出血副作用较小，且无过敏反应和免疫原性，无毒性反应。水蛭素羧基端是与凝血酶结合的结构域，对凝血酶有高度的亲和性，羧基端的12肽53—64aa是具有最大抗凝活性的最小肽段。采用水蛭素的另一个原因是其对结合于血栓上的凝血酶有亲和作用，具有一定的血栓靶向性。新生血栓中含有丰富的凝血酶，急性心肌梗死中病理状态下的凝血块就属于富含凝血酶的新生血栓（freshly formedclot）。基于水蛭素与凝血酶的高亲和性，融合蛋白就能针对病理状态下含丰富凝血酶的血栓，产生一定的靶向选择作用。本文首次将水蛭素12肽与瑞替普酶（r—PA）融合，希望获得更优质的蛋白药物：（1）它具有高效抗凝活性，能对机体中未形成血栓但已处于高凝的状态产生作用（2）具有高效的溶栓活性，对已形成的血栓具有溶栓作用（3）能防止溶栓后的再栓塞（4）具有一定的血栓靶向作用，选择性好（5）由于采用的r-PA和水蛭素12肽均是缺失突变体，相对于全长蛋白序列，其分子量更小，抗原性等副作用更小。具体实验如下：①水蛭素位于融合蛋白的C端：通过加端PCR，获得了含r-PA-柔性肽（Gly）3-水蛭素12肽的融合基因，再克隆到pET-21a载体上，经测序正确后转化大肠杆菌BL21（DE3）、BL21（DE3）pLysS、HMS174（DE3）、Origamai（DE3）中诱导表达，未见目的蛋白表达。将上述基因改换pBAD表达系统，连接到pBAD／g III A载体上，转化到大肠杆菌TOP10F’宿主细胞中，仍然未现表达。推测可能是由于基因空间结构的影响导致蛋白不表达。②水蛭素位于融合蛋白的N端：通过加端PCR，获得了含水蛭素12肽正确后转化大肠杆菌BL21（DE3）中，成功构建了HrP／BL21工程菌。工程菌在IPTG诱导下，表达的目的融合蛋白约占茵体总蛋白的12％。以包涵体形式存在。1L发酵液可以得到4g左右的湿菌体，超声破菌后可以得到2g左右的包涵体。经Triton洗涤后，溶解于变性液中，过Sephadex G-25柱初步复性，复性液在体外检测到抗凝和溶栓的活性。说明该融合蛋白具有溶栓抗凝双功能，与预期设计相符。提示该融合蛋白具有成为新一代溶栓药的潜力。