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目前有大量的证据支持放线共生放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans,A.a)是青少年牙周炎(Juvenile periodontitis,JP)的重要致病菌,尤其是其表面相关物质在细菌致病作用中具有重要意义,已受到广泛重视,但确切致病机理尚不清楚。有关放线共生放线杆菌表面相关物质对细胞、组织的生物学效应尚未见系统报道。 本课题采用盐析法提取放线共生放线杆菌表面相关物质,经高效液相色谱(HPLC)纯化,对其理化性质及对人牙龈、牙周膜成纤维细胞、成骨样细胞Mc3T3-E1的生物学效应进行了研究,配合动物实验,以期为此菌在牙周病、尖周病病因学研究提供可靠的实验资料。 一、放线共生放线杆菌表面相关物质的提取、纯化和理化性质检测 对放线共生放线杆菌液体培养,采用盐析法粗提,高效液相色谱纯化,提取了其溶于培养基中的表面相关物质。提取物呈灰白色絮状,主要有机成份为糖蛋白,内毒素含量极微,SDS-PAGE显示为多条泳带,成份复杂。提取物活性检测:经MTT法,细胞计数法,图像分析法结果显示:提取物可明显抑制成纤维细胞L929的分裂、增殖,使细胞及细胞核面积增大,100μg/ml浓度组与对照组差别显著(P<0.05),但不致细胞死亡,说明此提取物作用机理与内毒素明显不同。 二、放线共生放线杆菌表面相关物质对人牙龈、牙周膜成纤维细胞生长抑制作用 采用组织块法培养了人牙龈成纤维细胞,经抗波形丝蛋白和角蛋白染色证实,培养的成纤维细胞来源于中胚层。 细胞计数法和图像分析法观察了此物质对人牙龈成纤维细胞生长抑制作用。结果显示:此物质抑制作用明显,能抑制细胞的分裂、增殖,使细胞、细胞核面积增大,抑制作用呈浓度依赖性,100μg/ml时与对照组差别显著(P<0.05),细胞无明显死亡现象,有异于内毒素对细胞的作用。 采用流式细胞仪技术(FCM)观察了此物质对人牙龈成纤维细胞的DNA合成和细胞周期的影响。结果显示:100μg/ml浓度组明显抑制