【摘 要】
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目的:研究子痫前期患者CACNA1D基因突变对血管内皮细胞Cav1.3蛋白和ET-1表达的影响,探索子痫前期发病原因,以寻求新的监测手段及干预靶点,为预防和治疗提供新的思路。方法:（1）取得健康产妇分娩的新生儿脐带,采用胶原酶灌注消化法,从中分离人脐静脉内皮细胞,进行培养观察;运用细胞免疫荧光技术,根据内皮细胞特异性表达血管性血友病因子,对细胞进行标记鉴定,确保后续研究对象为内皮细胞。（2）扩增C
【基金项目】
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国家青年科学基金项目（No.81800363）:CACNA1D基因变异与妊娠性高血压疾病免疫耐受异常的关联性研究与机制探讨; 福建省医学创新课题（No.2018-CX-4）:CACNA1D基因变异在子痫前期发病中的作用
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目的:研究子痫前期患者CACNA1D基因突变对血管内皮细胞Cav1.3蛋白和ET-1表达的影响,探索子痫前期发病原因,以寻求新的监测手段及干预靶点,为预防和治疗提供新的思路。方法:（1）取得健康产妇分娩的新生儿脐带,采用胶原酶灌注消化法,从中分离人脐静脉内皮细胞,进行培养观察;运用细胞免疫荧光技术,根据内皮细胞特异性表达血管性血友病因子,对细胞进行标记鉴定,确保后续研究对象为内皮细胞。（2）扩增CACNA1D基因的c DNA序列,经过内切酶剪切后,由连接酶连至pc DNA3.1（+）载体;转化连接产物,挑出克隆,扩大培养,少量提取质粒,行DNA测序鉴定,同时合成分别具有CACNA1D基因c.A920G,c.G1345A,c.A1697G,c.G2242A,c.G2689A,c.C3914T,c.G4475A这7个突变位点的pc DNA3.1（+）-CACNA1D载体,并经DNA测序鉴定,确保合格的质粒载体用于后续实验。（3）将构建好的携带有CACNA1D基因野生型和上述7个突变位点的pc DNA3.1（+）-CACNA1D载体,运用脂质体转染法,分别转染至内皮细胞;通过Western blot研究CACNA1D基因突变对该基因编码的Cav1.3蛋白表达的影响,接着选取与野生型相比Cav1.3蛋白表达具有阳性差异的突变位点,通过Western blot和RT-qPCR研究CACNA1D基因突变对内皮细胞ET-1 mRNA和蛋白表达的影响。结果:（1）成功分离人脐静脉内皮细胞,并完成鉴定,可用于后续实验研究。（2）成功构建pc DNA3.1（+）目的基因载体,分别携带有CACNA1D野生型基因,以及CACNA1D c.A920G,c.G1345A,c.A1697G,c.G2242A,c.G2689A,c.C3914T,c.G4475A突变型基因,均测序鉴定正确,可用于后续实验研究。（3）上述真核表达载体均成功转染至内皮细胞,并表达相应的Cav1.3蛋白;其中与野生型相比,可引起内皮细胞Cav1.3蛋白表达增加的有c.A920G（P=0.0325）,c.G1345A（P=0.0309）,c.G2242A（P=0.0356）,c.G2689A（P=0.0432）,c.G4475A（P=0.0419）;然后将这5个突变型与野生型相比,均可引起内皮细胞ET-1 mRNA表达的增加c.A920G（P=0.0452）,c.G1345A（P=0.0162）,c.G2242A（P=0.0460）,c.G2689A（P=0.0146）,c.G4475A（P=0.0311）;同样与野生型相比,亦可引起内皮细胞ET-1蛋白表达的增加c.A920G（P=0.0143）,c.G1345A（P=0.0115）,c.G2242A（P=0.0359）,c.G2689A（P=0.0299）,c.G4475A（P=0.0235）。结论:（1）成功分离获取并鉴定人脐静脉内皮细胞。（2）pc DNA3.1（+）-CACNA1D载体构建成功。（3）子痫前期患者CACNA1D基因c.A920G,c.G1345A,c.G2242A,c.G2689A,c.G4475A突变可引起内皮细胞Cav1.3蛋白、ET-1 mRNA和蛋白表达的增加。
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