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目的葡萄膜黑色素瘤是成人最常见的眼内原发性恶性肿瘤并且有很高的致死率。因此迫切需要探究一种有效、无创的方法治疗葡萄膜黑色素瘤。光遗传作为一种新兴的技术,通过可见光的照射控制信号的激活。由于需要手术植入电极并且有相对较弱的组织穿透性,光遗传技术的临床转化受到限制。因为人眼是一个透光系统,将该技术用于眼科疾病的治疗有其独特的优势,所以我们假设采用光遗传学方法无需手术即可有效治疗葡萄膜黑色素瘤。为评估该方法的可行性,我们应用一套遗传编码的光遗传系统Fas-CIB1-EGFP和CRY2-mCherryFADD,该系统可在蓝光诱导下可逆性地结合与解离,从而激活胞内凋亡信号通路。在本实验中,我们分别观察该光遗传系统在体内及体外实验是否具有治疗效果,从而为治疗葡萄膜黑色素瘤探寻一种新的有前景的治疗方法。方法1.细胞转染及转染效率的检测:将质粒Fas-CIB1-EGFP和CRY2-mCherryFADD通过Lipofectamine 3000共转染到B16细胞中。通过荧光显微镜分别在波长为488 nm和561 nm激发光作用下成像EGFP和mCherry,对该光遗传系统质粒体系借助脂质体转染法转染B16细胞的效率进行检测。2.活细胞成像:488nm蓝光照射后,共聚焦显微镜下实时捕捉蓝光激活B16细胞中的FADD向Fas异位。3.体外蓝光诱导的光遗传系统使B16细胞凋亡的检测:B16细胞被分为照射蓝光组、STS组(阳性对照)、共转染质粒且照射蓝光组、共转染质粒组。待蓝光照射完成24小时后,分别用Annexin V-FITC/PI染色通过流式细胞仪检测该光遗传系统对B16细胞凋亡的影响,用Hoechst-PI双染法检测凋亡细胞B16细胞核的变化及各组凋亡细胞的比例,以及用抗体caspase-3和活化的caspase-3进行Western blot分析。4.小鼠葡萄膜黑色素瘤模型的建立:向小鼠视网膜下注射B16细胞悬液,于造模后第7天,制作模型眼的石蜡切片及苏木精-伊红(HE)染色,观察小鼠眼内黑色素瘤的生长情况。5.蓝光控制的光遗传纳米系统的治疗方法:向48只小鼠眼睛注射B16细胞的第7天,将小鼠随机分为照蓝光组、注射质粒组、注射质粒联合照射蓝光组、Hanks’液组。每组12只。相应实验组注射质粒24h后,借助自主开发的蓝光自动控制系统,调整为每分钟照射蓝光10秒每天照射2小时,共7天。6.蓝光照射诱导体内光遗传系统结合的验证:于造模第7天,瘤内注射光遗传系统质粒体系24小时后,用蓝光照射小鼠眼睛,每分钟10秒,共2小时。迅速做冰冻切片,用波长为488nm和561nm的激光激发,共聚焦显微镜下观察。7.体内实验原位细胞凋亡检测(TUNEL)阳性细胞的成像和定量:上述4组小鼠经1周治疗之后,对肿瘤进行取材,运用TUNEL染色进行组织学分析及TUNEL阳性细胞的定量。8.评估葡萄膜黑色素瘤的凋亡程度:将不同实验组的小鼠眼球取出并拍照,比较大小,做冰冻切片及HE染色,测量计算并比较各组小鼠眼球肿瘤的体积。结果1.B16细胞转染成功,体外实验光遗传系统质粒体系转染效率约为40%。2.共聚焦显微镜下通过63倍油镜观察到在蓝光(488 nm)照射后,CRY2-mCherry-FADD与细胞膜上的Fas-CIB1-EGFP结合,而在黑暗中时,其从细胞膜上解离。3.流式细胞仪检测后分析示:共转染质粒+照蓝光组处于早期及晚期凋亡的细胞比例明显高于照射蓝光组与共转染质粒组(~*~*~*P<0.001)。4.Hoechst-PI双染法检测结果显示:共转染质粒+照蓝光组中凋亡细胞比例明显高于照射蓝光组与共转染质粒组(~*~*P<0.001)。5.Western blot条带结果显示:蓝光照射24小时后,共转染质粒+照蓝光组出现活化的caspase-3,但在照射蓝光组及共转染质粒组中未产生。6.小鼠眼内黑色素瘤模型制作成功。7.由488 nm和561 nm激光激发后,只有在注射质粒联合照射蓝光组肿瘤的细胞中,表达了带有绿色标记的融合蛋白Fas-CIB1-EGFP及带有红色标记的融合蛋白CRY2-mCherry-FADD,并且融合图像显示两者重合。8.TUNEL染色结果显示:注射质粒联合照射蓝光组标本TUNEL阳性率较高,明显高于照蓝光组和注射质粒组(~*~*P<0.01)。9.与照蓝光组和注射质粒组相比,注射质粒联合照射蓝光组的眼球体积和肿瘤体积均明显减小。结论无论在体内还是体外实验中,都可以证明应用Fas-CIB1-EGFP和CRY2-mCherry-FADD光控系统治疗葡萄膜黑色素瘤的疗效。这些结果为葡萄膜黑色素瘤或其他眼科疾病提供了一个新的治疗策略。