麦冬为百合科植物麦冬[Ophiopogon japonicus(L.f.)Ker-Gawl]的干燥块根,属临床常用滋阴中药,有养阴生津、润肺清心之功效,可用于治疗热病伤津、心烦口渴等病症。现代药理研究表明,麦冬在耐缺氧、增强心肌收缩力、抵抗心率失常、抗癌、抗肿瘤及降血糖等方面具有显著活性。研究发现,皂苷和黄酮是麦冬中两类主要的活性成分,但由于结构相似且含量不高,针对此类成分的研究十分有限。液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)具有专属、快速、灵敏等优点,在中药复杂体系多组分的定性和定量分析中具有明显优势。本研究即采用LC-MS技术对麦冬中化学成分进行了分析,并研究其药代动力学特征:鉴定了麦冬中皂苷和黄酮类成分,总结其电喷雾质谱裂解规律;建立麦冬和山麦冬中11种成分的含量测定方法,并用于不同产地的麦冬和山麦冬药材的比较;建立大鼠生物样品中麦冬黄酮和皂苷类成分的LC-MS定量分析方法,用于大鼠灌胃给与麦冬提取物后的药物动力学研究,并鉴定大鼠尿液、胆汁和血液中的麦冬皂苷、黄酮及其代谢产物,初步探索麦冬提取物在体内的药代动力学过程。第一部分麦冬中皂苷和黄酮类成分的鉴定目的:总结麦冬皂苷和麦冬黄酮类成分的质谱裂解规律,采用UPLC-Q-Tof-MS/MS技术,建立快速、高效的麦冬主要成分的鉴定方法。方法:通过电喷雾离子源正、负离子一级质谱扫描、母离子扫描和子离子扫描,研究9个麦冬化学成分对照品的质谱裂解途径,并总结规律。采用UPLC-Q-Tof-MS/MS技术对麦冬乙醇提取液进行Tof-MS-IDA-8MS/MS扫描,获取全扫描质量色谱图,采用Peak View 2.0数据处理软件中“Master View”、“Formular Finder”等分析功能,通过分析化合物保留时间、精确分子质量、元素组成、同位素丰度和一级、二级质谱图,筛选和鉴定麦冬中化学成分。色谱条件:Kinetex XB-C18色谱柱(100 mm×2.1 mm i.d.2.6μm);柱温:25℃;流动相:乙腈-1‰乙酸水,梯度洗脱;流速:0.4 m L/min。进样量:5μL。结果:总结出麦冬中9种化学成分(4个甾体皂苷、5个高异黄酮类化合物)的11项质谱裂解规律。据此采用UPLC-Q-Tof-MS/MS技术鉴定出麦冬提取物中30种化学成分(包括12个甾体皂苷、18个高异黄酮类类化合物),其中9种化合物与对照品比对可确证其化学结构,其余21种化合物通过分析元素组成、同位素丰度和一级、二级质谱图可被鉴定,误差范围在±5 ppm之内。结论:所建方法简便快捷、灵敏度高,可用于麦冬有效成分的定性分析,为麦冬药效物质基础研究提供了依据。第二部分麦冬与山麦冬中11种化学成分的测定与比较目的:建立LC-MS/MS方法同时测定麦冬及山麦冬药材中6种皂苷和5种黄酮类成分,并结合含量百分比柱状图与聚类分析对不同产地的麦冬和山麦冬进行了比较。方法:采用Phenomenex Luna C18(2)柱(150×2.00 mm,5μm);柱温:25℃;流动相:乙腈-1‰乙酸-水,梯度洗脱;流速:0.8 m L/min。进样量:10μL。采用电喷雾离子化源(ESI)及多反应离子监测(MRM)模式进行正负离子切换检测。源喷射电压(正离子)5500 V;(负离子)-4500 V;雾化温度为600℃;雾化气(GS1,N2):4.14×105 Pa;辅助气(GS2,N2):4.48×105 Pa;气帘气(N2):1.72×105 Pa。11种被测成分的监测离子对分别为m/z 719.5/393.3(麦冬皂苷Ra)、851.6/393.3(Ophiopojaponin C)、m/z855.8/287.3(麦冬皂苷D)、m/z 855.8/253.4(麦冬皂苷D’)、m/z 872.3/413.5(短葶山麦冬皂苷C)、m/z 723.6/269.3(山麦冬皂苷B)、m/z 361.2/237.8(麦冬黄烷酮E)、m/z 341.1/178.0(麦冬二氢黄烷酮A)、m/z 327.1/178.0(麦冬二氢黄烷酮B)、m/z 355.0/193.2(麦冬黄烷酮C)、和m/z 339.0/217.8(麦冬黄酮A)。用所建立的方法对不同来源的53批麦冬及山麦冬进行分析(包括16批麦冬、19批短葶山麦冬、9湖北山麦冬和9批麦冬和短葶山麦冬的混合品)。结果:所测11种成分在测定浓度区间线性关系良好,r2>0.9915;日内和日间精密度分别小于3.7%和4.2%;平均回收率95.3%~106.7%;稳定性、检测限和定量限均符合要求。样品测定结果表明,麦冬富含皂苷和黄酮两类物质,而山麦冬皂苷类成分含量较高,黄酮含量极低。黄酮类化合物可能成为区别麦冬和山麦冬的重要标志。运用聚类分析成功区分麦冬和山麦冬药材,不同产地的麦冬化学成分差异较大,而山麦冬差异较小。结论:该法简便快捷,选择性好,灵敏度高,可用于麦冬及山麦冬中11中化学成分的含量测定,本法为麦冬及山麦冬药材的质量分析与评价提供了有意义的依据和补充。第三部分麦冬中5种成分在大鼠血浆中的药物动力学研究目的:建立可同时测定大鼠血浆中麦冬皂苷D、麦冬黄烷酮E、麦冬黄酮A、麦冬二氢黄烷酮A和麦冬二氢黄烷酮B含量的UPLC-MS/MS方法,并用于大鼠灌胃给与麦冬提取物后该5种成分的药代动力学研究。方法:大鼠灌胃给与麦冬提取物后,分别于给药后0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、12、24、36 h大鼠眼内眦静脉丛取血,制备血浆,采用乙腈沉淀蛋白后进行分析,以补骨脂素作为内标。乙腈-0.3‰乙酸水溶液作为流动相梯度洗脱,流速0.4 m L/min,色谱柱为Kenetix C18柱(50 mm×3 mm,2.6μm),柱温25℃。采用电喷雾离子(ESI)源,MRM及正负离子同时监测模式。进样量:10μL。结果:本法属性强、灵敏度高、重现性好,可用于大鼠灌胃给与麦冬提取物后血浆中麦冬皂苷D、麦冬黄烷酮E、麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮A和甲基麦冬黄烷酮B的药代动力学研究。血浆中麦冬黄烷酮E、麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮A和甲基麦冬黄烷酮B在测定浓度范围内均具有良好的线性范围(r<0.9931)。药动学结果表明,所测麦冬黄酮类成分虽具有相似的化学结构,但药时曲线和药动学参数却表现显著差异,而麦冬皂苷D的血药浓度较低,推测可能口服吸收较差。结论:建立了一种灵敏度高、专属性强的UPLC-MS法测定大鼠血浆中麦冬皂苷D、麦冬黄烷酮E、麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮A和甲基麦冬黄烷酮B,并用于这些物质的药代动力学研究。第四部分麦冬中8种成分在大鼠胆汁和尿液中的排泄动力学研究目的:建立UPLC-MS法测定大鼠口服麦冬提取物后尿液中8种化合物的浓度,胆汁中4种化合物的浓度;并用于其尿液和胆汁的排泄学研究。方法:色谱柱为Kenetix C18柱(50 mm×3 mm,2.6μm),柱温25℃;流动相为乙腈A-0.3‰乙酸水溶液B,梯度洗脱,洗脱程序如下:0-3min,40-50%A;3-6min,50-90%A,流速为0.4m L/min,进样量:5μL。电喷雾离子源(ESI源),源温度600℃。采用正负离子同时检测,多重反应监测(MRM)模式扫描。SD大鼠12只,随机分成两组,每组6只,分别灌胃给予麦冬提取物后,一组收集给药后0-1h,1-3h,3-5h,5-7h,7-9h,9-12h和12-24h时间段胆汁并记录体积,一组收集给药后0-4h,4-8h,8-12h,12-24h,24-36h,36-48h,48-60h和60-72h时间段尿液并记录体积。用所建方法测定大鼠灌胃给与麦冬提取物后尿液和胆汁中麦冬皂苷和麦冬黄酮的累积排泄量。结果:大鼠尿液和胆汁中内源性物质不影响8种被测物和内标的测定。尿液中8种被测成分线性良好(r>0.9947),日内和日间RSD均小于11.9%,提取回收率均大于63.2%,基质效应为87.3%-105.7%。胆汁中4种所测成分线性良好(r>0.9956),日内和日间RSD均小于10.4%,提取回收率均大于68.9%,基质效应为84.5%-103.6%。实验结果表明尿液和胆汁中原型物质累积排泄量远小于给药量,提示所测成分在体内可能经生物转化,产生了大量的代谢物。结论:本研究首次测定了大鼠灌胃麦冬提取物后尿液中8种组分和胆汁4种组分。该法简便,灵敏,可满足生物样品中微量麦冬皂苷和黄酮类化合物的测定要求,对麦冬的进一步物质基础研究有重要意义。第五部分麦冬在大鼠体内的吸收组分及其代谢物鉴定目的:建立UPLC-Q-Tof-MS/MS技术鉴定大鼠灌胃麦冬提取物后尿液、胆汁和血浆中麦冬皂苷和黄酮类成分及其代谢物的方法,探索麦冬主要活性物质的体内代谢途径。方法:色谱条件:Kinetex XB-C18色谱柱(100 mm×2.1 mm i.d.2.6μm);柱温:25℃;流动相为乙腈(A)-1‰乙酸-水(B),梯度洗脱;流速:0.4 m L/min。进样量:5μL。SD大鼠灌胃麦冬提取物后,收集0-24h尿液,0-24h胆汁和0-12h血样制备含药样品,并与相同条件下空白生物样品及药材提取物图谱对比,采用Peak View 2.0和Metabolite Pilot数据处理软件,通过分析化合物保留时间、精确分子质量、元素组成、同位素丰度和一级、二级质谱图,筛选和鉴定尿液中麦冬皂苷和黄酮类成分及其代谢物。结果:建立了大鼠灌胃麦冬提取物后尿液、胆汁和血浆中麦冬活性物质及其代谢物的鉴定方法,共鉴定出19个原型成分和20个代谢产物。结论:本研究所建方法简便高效,为麦冬药效物质基础的阐明提供了依据。皂苷类化合物未发现代谢产物,黄酮类化合物代谢主要途径包括氧化、去甲基化、硫酸化、甲基化、葡萄糖醛酸化等。