目的:见血清是我国西南地区民间习用药,始载于《植物名实图考》,味苦性寒,具有凉血止血、清热解毒的功效。目前,见血清药材质量标准仅收载于《四川省中药材标准》中,主要为性状、显微鉴别等常规检测,缺乏相关定量检测方法;同时,少量文献报道其具有较好的止血凝血作用,但其发挥功效的药效物质基础尚不明确。因此,为进一步提高见血清药材及提取物的质量标准,探析见血清不同极性部位的谱效关系,本研究拟采用高效液相色谱法(HPLC),对不同产地的见血清药材建立指纹图谱,并在相似度评价基础上,结合聚类分析(HCA)和主成分分析(PCA),对10批次药材品质及其指纹图谱共有峰进行系统评价;同时,在上述研究基础上,构建见血清不同极性部位HPLC指纹图谱,并进行系列药效学试验,运用灰色关联度分析及双变量相关分析等现代数学分析模型,对见血清不同极性部位指纹图谱与不同药效进行谱效学分析,探寻不同部位的最优药效与指纹图谱间的对应关系,以期为见血清药材质量控制的提高、药效物质基础的揭示,以及药材资源开发提供科学依据。方法:1.不同产地见血清药材指纹图谱研究:采用高效液相色谱法(HPLC),对10批次不同产地的见血清药材建立指纹图谱,得到共有峰色谱图信息,通过对照品比对确认共有峰物质;运用软件“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”,对指纹图谱进行相似度评价;并在此基础上运用软件SPSS 23以及Simca 14.1等软件对上述10批次药材进行聚类分析与主成分分析,完成不同产地见血清成分差异的研究与品质评价。2.不同极性部位见血清提取物的谱效关系研究:(1)见血清不同极性部位指纹图谱的建立。采用80%乙醇回流提取见血清药材,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇对醇提提取液进行梯度萃取,获得见血清不同极性部位提取物;运用HPLC建立见血清不同极性部位的指纹图谱,并确定共有峰。(2)见血清不同极性部位的药效学研究。分别采用剪尾法、玻片法、毛细管法观察见血清不同极性部位的止血凝血作用;采用扭体法、甩尾法、福尔马林法及热板法观察上述部位的镇痛作用;采用角叉菜足肿胀法、琼脂肉芽肿法分析其抗炎作用,并检测其相关炎症因子。(3)见血清不同极性部位的谱效关系分析。结合上述研究结果,运用灰色关联度分析及双变量相关分析,对见血清不同极性部位的共有峰与不同药效作用间的谱效关系进行系统分析,明确见血清的“功效图谱”。结果:1.不同产地见血清药材指纹图谱研究:研究建立10批次不同产地见血清药材HPLC指纹图谱,并确定40个共有峰,指认2号峰为原儿茶酸,4号峰为香草酸,6号峰为对羟基肉桂酸,29号峰为柠檬油素。采用软件“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”进行相似度评价,除S3、S6两个批次以外,其余各批次相似度均在0.9以上,符合指纹图谱要求。采用软件SPSS 23.0对10批次见血清药材进行聚类分析(HCA),结合聚类树状图可知,10批次不同产地的见血清药材分类存在产地交叉情况,即药材中化学成分含量不受产地的影响,聚类分析结果与主成分分析结果(PCA)相一致;同时,通过偏最小二乘法判别分析(PLSDA)模型发现,峰1、2、4、5、6、8、12、15、20、21、23、27、30、35、37、38、39为造成样品组间差异的主要色谱峰;计算10批次见血清药材样品的品质综合得分,结果显示四川乐山(S10)样品的综合得分最高(2.470),品质最好。2.不同极性部位见血清提取物的谱效关系研究:(1)建立见血清不同极性部位HPLC指纹图谱,并确定了53个共有峰,其中乙醇部位共有峰49个,正丁醇部位共有峰33个,乙酸乙酯部位共有峰23个,石油醚部位共有峰5个。(2)相关药效学实验:(1)止血凝血作用:三项凝血止血实验结果显示,见血清石油醚部位和乙酸乙酯部位均具有明显的促进凝血,增强止血作用,尤以石油醚部位最为明显。(2)镇痛作用:见血清醇提部位与正丁醇部位对小鼠扭体实验与福尔马林实验II相反应均显示出较好的外周镇痛作用,以乙醇部位效果最好;同时,中枢镇痛实验结果显示,见血清乙酸乙酯部位与醇提部位对小鼠热板实验、甩尾实验及福尔马林实验的I相反应,均显示出较好的镇痛作用,尤以乙酸乙酯部位疗效最好。(3)抗炎作用:见血清醇提部位与正丁醇部位均能明显抑制小鼠角叉菜致足肿胀和琼脂致肉芽肿,降低炎症因子TNF-α及IL-1β的含量,尤以乙醇部位作用最为明显。(3)运用灰色关联度分析及双变量相关分析研究见血清不同极性部位指纹图谱共有峰与上述药效作用的谱效关系,发现:(1)止血、凝血方面,46与49号峰相关性较强,而20、22、24号峰相关性较差;(2)外周镇痛方面,34与22号峰相关性较强,而14与35号峰相关性较差;(3)中枢镇痛方面,5与53号峰的相关性较强,而6与9号峰相关性较差;(4)抗炎作用方面,19、20、21、22、24、25、26、27、28号峰与药效相关较强,而14与35号峰相关性较差。上述共有峰分布的极性部位与药效结果相一致,即石油醚部位富含止血凝血的峰,乙酸乙酯部位富含中枢性镇痛的峰,而醇提部位富含外周镇痛及抗炎的峰。结论:1.建立见血清药材HPLC指纹图谱,各批次见血清整体峰的保留时间与对照图谱基本一致,可从整体反应见血清药材质量;在相似度评价的基础上,进行聚类分析与主成分分析,对10批次不同产地见血清药材做出品质评价。本研究方法简便易行,数据可靠,为见血清药材的质量控制与评价,以及药材资源的进一步开发提供科学依据。2.分别建立见血清药材不同极性部位HPLC指纹图谱,对上述部位进行止血凝血、镇痛、抗炎等多“功效”药理作用比较,并结合谱效学分析方法,确定见血清“功效图谱”,即发挥药效作用的极性部位与药效物质峰群的相关性。本研究方法简便,准确可行,为见血清“药效活性组分群”及药效物质基础的揭示提供科学依据。