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背景室性心律失常往往继发于运动和情绪激动等交感神经兴奋的情况下,循环及组织局部儿茶酚胺浓度的增高改变了心肌细胞离子通道的特性,是导致恶性室性心律失常发生的重要原因。心肌细胞膜上分布着大量离子通道,作为参与心肌细胞动作电位的主要电流,快激活延迟整流钾电流I<sub>kr是心肌细胞复极化的主要电流,它的抑制可使动作电位时程延长。编码人类快激活延迟整流钾电流α亚单位的基因为hERG基因,该通道的基因突变导致的I<sub>kr电流减少是遗传性长QT综合征-2（LQTS-2）的发病因素。另外,hERG基因是临床广泛应用的I<sub>I<sub>I<sub>类抗心律失常药物的作用靶点之一。许多抗心律失常药物及非抗心律失常药物对hERG通道的过度抑制是获得性长QT综合征的主要发病机制。由运动或情绪激动引起的交感神经兴奋激活心肌细胞的α和β肾上腺素受体。目前至少有9种肾上腺素受体已被明确:α1A、α1B、α1D、α2A、α2B、α2C、β1、β2及β3。人类心肌细胞上主要为α1及β肾上腺素受体,近期研究表明α1和β肾上腺素受体激活后可调控hERG/I<sub>kr电流的大小,但α1及β肾上腺素受体通过何种亚型调控hERG/I<sub>kr电流以及确切的调控机制尚需进一步的研究来阐明。目的采用全细胞膜片钳技术研究α1和β肾上腺素受体及其亚型对豚鼠心室肌细胞快激活延迟整流钾电流的调控及可能的机制,探讨应激触发室性心律失常发生的机制。内容与方法1.成年豚鼠心室肌细胞的分离:雄性豚鼠,体重250-300g,采用Langendorff灌流装置逆行灌流心脏,酶解分离出单个心室肌细胞。2.豚鼠心室肌细胞快激活延迟整流钾电流（I<sub>kkr）的记录:分离出的细胞悬液置于细胞池中,采用全细胞方式膜片钳技术记录豚鼠心室肌细胞的快激活延迟整流钾电流。膜片钳参数为:钳制电压-40mv,预刺激从-40mv至+40mv,脉宽200ms,刺激从相应电压降至-40mv,脉宽600ms,记录I<sub>kr尾电流。3.α1肾上腺素受体激活对豚鼠心室肌细胞I<sub>kkr电流的调控:3.1.α1肾上腺素受体激活对I<sub>kkr电流的影响:持续灌流含有选择性α1肾上腺素受体激动剂苯肾上腺素（0.0001μmol/L-100μmol/L）的细胞外液,记录苯肾上腺素灌流前后的I<sub>kr电流。分别由灌流系统持续灌流含有哌唑嗪（α1肾上腺素受体阻断剂）或5-甲基乌拉地尔（α1A肾上腺素受体阻断剂）或chlorethylclonidine（α1B肾上腺素受体阻断剂）或BMY7378（α1D肾上腺素受体阻断剂）的细胞外液;再给予苯肾上腺素干预,记录苯肾上腺素灌流前后的I<sub>kr电流。3.2.蛋白激酶A和蛋白激酶C在α1肾上腺素受体激动剂影响I<sub>kkr电流中的作用:分离出的单个心室肌细胞室温分别与特异性蛋白激酶A（PKA）抑制剂KT5720（2.5μmol/L）或特异性蛋白激酶C（PKC）抑制剂chelerythrine（1μmol/L）共同孵育1小时后灌流含有苯肾上腺素的细胞外液,记录苯肾上腺素灌流前后的I<sub>kr电流。4.β肾上腺素受体激活对豚鼠心室肌细胞I<sub>kkr电流的调控:4.1.β肾上腺素受体激活对I<sub>kkr电流的影响:持续灌流含有非选择性β肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素（0.001μmol/L-100μmol/L）的细胞外液,记录异丙肾上腺素灌流前后的I<sub>kr电流。分别由灌流系统持续灌流含有普萘洛尔（β肾上腺素受体阻断剂）或CGP20712A（β1肾上腺素受体阻断剂）或I<sub>CI<sub>118551（β2肾上腺素受体阻断剂）的细胞外液;再给予异丙肾上腺素干预,记录异丙肾上腺素灌流前后的I<sub>kr电流。4.2.β1肾上腺素受体激动剂对I<sub>kkr电流的影响:持续灌流含有选择性β1肾上腺素受体激动剂扎莫特罗（0.01μmol/L-100μmol/L）的细胞外液,记录扎莫特罗灌流前后的I<sub>kr电流。4.3.蛋白激酶A、蛋白激酶C、磷脂酶C和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶在β1肾上腺素受体激动剂影响I<sub>kkr电流中的作用:分离出的单个心室肌细胞分别用特异性PKA抑制剂KT5720（2.5μmol/L）或特异性PKC抑制剂chelerythrine（1μmol/L）或特异性PLC抑制剂U73122（100nmmol/L）孵育1小时或特异性CaMKI<sub>I<sub>抑制剂KN93（10μmol/L）孵育30小时,灌流含有扎莫特罗的细胞外液,记录扎莫特罗灌流前后的I<sub>kr电流。5.α1和β肾上腺素受体在调控I<sub>kr电流中的交互作用5.1.急性激活α1肾上腺素受体对β肾上腺素受体激动剂调控I<sub>kkr电流的影响:先灌流含有苯肾上腺素的细胞外液10min,记录苯肾上腺素灌流前后的I<sub>kr电流;再灌流含有异丙肾上腺素的细胞外液10min,记录异丙肾上腺素作用后的I<sub>kr电流。5.2.急性激活β肾上腺素受体对α1肾上腺素受体激动剂调控I<sub>kkr电流的影响:先灌流含有异丙肾上腺素的细胞外液10min,记录异丙肾上腺素灌流前后的I<sub>kr电流。再灌流含有苯肾上腺素的细胞外液10min,记录苯肾上腺素作用后的I<sub>kr电流。结果1.豚鼠心室肌细胞I<sub>kkr电流的记录:用全细胞膜片钳技术可记录到豚鼠心室肌细胞的I<sub>kr尾电流,该电流可被1μmol/L的多非立特完全阻断。I<sub>kr电流受温度影响,当灌流槽温度由22℃逐渐升高至37℃,I<sub>kr电流亦逐渐增大。当预刺激电压为+40mV时,I<sub>kr电流电流密度由22℃时的0.28±0.07pA/pC增加到37℃时的0.62±0.07pA/pC。2.α1肾上腺素受体激活对豚鼠心室肌细胞I<sub>kkr电流的调控:2.1.α1肾上腺素受体及其亚型对豚鼠心室肌细胞I<sub>kr电流的影响:选择性α1上腺素对I<sub>kr电流的减低作用;而β2肾上腺素受体阻断剂I<sub>CI<sub>118551不能减弱异丙肾上腺素对I<sub>kr电流的减低作用。3.2.β1肾上腺素受体对豚鼠心室肌细胞I<sub>kkr电流的影响:选择性β1肾上腺素受体激动剂扎莫特罗也可剂量依赖性地降低I<sub>kr电流。依次灌流含0.01、0.1、1、10、100μmol/L的扎莫特罗可使I<sub>kr电流降为原来的基础电流大小的0.96±0.12、0.85±0.13、0.67±0.12、0.59±0.10、0.55±0.11。开始即灌流10μmol/L扎莫特罗可使I<sub>kr电流减低到基础电流大小的0.56±0.04。3.3.蛋白激酶A、磷脂酶C/蛋白激酶C和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶在β1肾上腺素受体激动剂影响I<sub>kkr电流中的作用:（1）正常对照组（细胞未用任何蛋白酶抑制剂预处理）:10μmol/L扎莫特罗可使I<sub>kr电流减低到原基础电流大小的0.56±0.04。（2）KT5720组（细胞先用特异性PKA抑制剂KT5720预孵育1小时）:10μmol/L扎莫特罗能使I<sub>kr电流减低到基础电流大小0.87±0.03,与正常对照组相比有明显统计学差异。（3）U73122组（细胞先用PLC抑制剂U73122预孵育1小时）:10μmol/L扎莫特罗能使I<sub>kr电流减低到基础电流大小的0.91±0.07,与正常对照组相比有明显统计学差异。（4）Chelerythrine组（细胞先用特异性PKC抑制剂chelerythrine预孵育1小时）:10μmol/L扎莫特罗仅能使I<sub>kr电流减低到基础电流大小的0.71±0.01,与正常对照组相比有明显统计学差异。（5）KN93组（细胞用特异性CaMKI<sub>I<sub>抑制剂KN93预孵育30分钟）:10μmol/L扎莫特罗仍能使I<sub>kr电流减低到原电流大小的0.68±0.07,与正常对照组相比相比无统计学差异。4.α1和β肾上腺素受体在调控豚鼠心室肌细胞I<sub>kkr电流中的交互作用:4.1.急性激活α1肾上腺素受体对β肾上腺素受体激动剂调控I<sub>kkr电流的影响:若细胞未先加用α1肾上腺素受体激动剂苯肾上腺素,β肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素能使I<sub>kr电流降为基础电流大小的0.55±0.06。若细胞先加用苯肾上腺素,异丙肾上腺素则不能降低I<sub>kr电流的大小,提示α1肾上上腺素对Ikr电流的减低作用;而β2肾上腺素受体阻断剂ICI118551不能减弱异丙肾上腺素对Ikr电流的减低作用。3.2.β1肾上腺素受体对豚鼠心室肌细胞Ikkr电流的影响:选择性β1肾上腺素受体激动剂扎莫特罗也可剂量依赖性地降低Ikr电流。依次灌流含0.01、0.1、1、10、100μmol/L的扎莫特罗可使Ikr电流降为原来的基础电流大小的0.96±0.12、0.85±0.13、0.67±0.12、0.59±0.10、0.55±0.11。开始即灌流10μmol/L扎莫特罗可使Ikr电流减低到基础电流大小的0.56±0.04。3.3.蛋白激酶A、磷脂酶C/蛋白激酶C和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶在β1肾上腺素受体激动剂影响Ikkr电流中的作用:（1）正常对照组（细胞未用任何蛋白酶抑制剂预处理）:10μmol/L扎莫特罗可使Ikr电流减低到原基础电流大小的0.56±0.04。（2）KT5720组（细胞先用特异性PKA抑制剂KT5720预孵育1小时）:10μmol/L扎莫特罗能使Ikr电流减低到基础电流大小0.87±0.03,与正常对照组相比有明显统计学差异。（3）U73122组（细胞先用PLC抑制剂U73122预孵育1小时）:10μmol/L扎莫特罗能使Ikr电流减低到基础电流大小的0.91±0.07,与正常对照组相比有明显统计学差异。（4）Chelerythrine组（细胞先用特异性PKC抑制剂chelerythrine预孵育1小时）:10μmol/L扎莫特罗仅能使Ikr电流减低到基础电流大小的0.71±0.01,与正常对照组相比有明显统计学差异。（5）KN93组（细胞用特异性CaMKII抑制剂KN93预孵育30分钟）:10μmol/L扎莫特罗仍能使Ikr电流减低到原电流大小的0.68±0.07,与正常对照组相比相比无统计学差异。4.α1和β肾上腺素受体在调控豚鼠心室肌细胞Ikkr电流中的交互作用:4.1.急性激活α1肾上腺素受体对β肾上腺素受体激动剂调控Ikkr电流的影响:若细胞未先加用α1肾上腺素受体激动剂苯肾上腺素,β肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素能使Ikr电流降为基础电流大小的0.55±0.06。若细胞先加用苯肾上腺素,异丙肾上腺素则不能降低Ikr电流的大小,提示α1肾上腺素受体激活可抑制β肾上腺素受体激活对Ikr电流的降低作用。4.2.急性激活β肾上腺素受体对α1肾上腺素受体激动剂调控Ikkr电流的影响:细胞若未预先加用β肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素,α1肾上腺素受体激动剂苯肾上腺素能使Ikr电流降为基础电流大小的0.58±0.04。若细胞先加用了异丙肾上腺素,苯肾上腺素能使Ikr电流降为基础电流大小的0.80±0.02,提示β肾上腺素受体激活可减弱α1肾上腺素受体激活对Ikr电流的降低作用。结论1.α1肾上腺素受体激活可浓度依赖性地减弱豚鼠心肌细胞的Ikr电流,此作用主要通过α1A肾上腺素受体介导。2.特异性PKA和PKC抑制剂均可减弱苯肾上腺素对Ikr电流的降低作用,提示α1A受体激活对Ikr电流的调控依赖于PKA以及PKC的激活。3.β肾上腺素受体激活可剂量依赖性地减弱豚鼠心肌细胞的Ikr电流,此作用主要通过β1肾上腺素受体介导。4.β1肾上腺素受体的瞬时激活对Ikr电流的调控作用依赖于PKA、PLC以及PKC的激活,而与CaMKII的激活无关。5.α1肾上腺素受体激活可抑制β肾上腺素受体激活对Ikr电流的降低作用,β肾上腺素受体激活亦可减弱α1肾上腺素受体激活对Ikr电流的降低作用;提示α1和β肾上腺素受体在对Ikr电流的调控上可能存在交互作用。