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禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli,APEC）作为一种分布广泛的革兰氏阴性菌,可引起鸡、鸭、鹅等多种禽类发病。由于APEC具有人兽共患的潜力,因此,加强对APEC的防治具有较高的公共卫生学意义。APEC毒力因子种类繁多,VI型分泌系统（Type VI secretion systems,T6SS）作为APEC毒力因子中的一种,在APEC的致病过程中发挥重要作用。Clp V蛋白是T6SS-2中能量相关蛋白,在T6SS-2分泌效应蛋白的过程中起到提供能量的作用。溶血素共调节蛋白（Hemolysin-coregulated protein,Hcp）是T6SS-2的效应蛋白,其不仅参与APEC的致病过程,在细菌运动能力、生物膜形成能力、细菌间的竞争等方面均发挥作用。研究发现APEC可通过呼吸道感染,Clp V及Hcp都是T6SS中的核心蛋白,但关于Clp V及Hcp在APEC感染雏鸡气管黏膜上皮细胞过程中的致病作用尚不清楚。为探究T6SS-2对气管黏膜上皮细胞的影响,本研究首先利用APEC菌株AE17感染雏鸡气管,并通过转录组学测序探究AE17对雏鸡气管黏膜上皮细胞的致病作用;利用Red同源重组技术构建T6SS-2 clp V基因缺失株及回复株,将clp V基因缺失株通过气管感染的方式感染雏鸡并进行m RNA测序;此外,通过气管注射缺失株△hcp2a、△hcp2b,分别利用m RNA测序及蛋白质组学测序探究缺失株△hcp2a、△hcp2b对雏鸡气管黏膜上皮细胞的致病作用。具体研究内容及结果如下:1.AE17对雏鸡气管黏膜上皮细胞的致病作用将APEC菌株AE17以50μL（1×10~8cfu/m L）的剂量感染雏鸡气管,雏鸡出现精神萎靡、食欲不振、排黄绿色粪便的现象。病理切片结果显示气管、肝脏、脾脏、肺脏均有不同程度水肿、充血和嗜中性粒细胞浸润现象。组织载菌量结果显示在感染后的4 h、8 h、12 h、24 h,气管、肝脏、脾脏、肺脏均有菌体的定植,表明AE17可以通过气管注射的方式感染机体的其他器官。m RNA测序结果显示感染AE17菌株12 h和24 h后,分别筛选到436、340个差异表达基因。荧光定量PCR验证部分差异表达基因,与测序结果趋势一致。KEGG分析结果显示,感染12 h后,细胞因子与细胞因子受体相互作用信号通路、Toll样受体通路富集了大量的差异表达基因;感染24 h后,差异表达基因主要富集在细胞周期、DNA复制等通路。2.clp V基因缺失株的构建及其对雏鸡气管黏膜上皮细胞转录组的影响利用Red同源重组技术,以菌株AE17为野生株,成功构建clp V基因缺失株△clp V,利用质粒p STV28成功构建回复株C-clp V。生长曲线测定结果显示,clp V基因对细菌的生长速率无影响;运动性试验结果显示,与野生株AE17相比,△clp V的运动能力降低（P<0.05）;生物膜形成能力测定结果显示,clp V基因缺失后,生物膜形成能力增强（P<0.05）;DF-1细胞粘附试验结果显示,与野生株AE17相比,△clp V粘附细胞的能力上升（P<0.01）,而在入侵试验中,缺失株△clp V的入侵能力下降（P<0.01）。m RNA测序结果显示,感染△clp V菌株12 h和24 h后,分别筛选到108、59个差异表达基因。KEGG分析结果显示,感染12 h后,差异表达基因主要富集在细胞因子与细胞因子相互作用受体相互作用通路、内质网中的蛋白质加工通路,感染24 h后,差异表达基因主要富集在紧密连接、内吞通路。3.缺失株△hcp2a、△hcp2b对雏鸡气管黏膜上皮细胞转录组学及蛋白质组学的影响将△hcp2a菌株、△hcp2b菌株通过气管注射的方式感染雏鸡,测序结果表明,在感染△hcp2a菌株12 h和24 h后,分别筛选到268、138个差异表达基因;感染△hcp2b菌株12 h和24 h后,共筛选到144、135个差异表达基因。KEGG分析结果显示,感染△hcp2a菌株12 h、24 h后,差异表达基因主要富集在Toll样受体通路、细胞因子与细胞因子受体相互作用通路等;感染△hcp2b菌株12 h、24 h后,差异表达基因主要富集在Toll样受体通路、内质网中的蛋白质加工通路等。对感染12 h后的雏鸡气管黏膜上皮细胞进行蛋白质组学测序,结果表明,在感染△hcp2a菌株和感染△hcp2b菌株组中,分别筛选到79个、107个差异蛋白。KEGG分析结果表明,在感染△hcp2a、△hcp2b菌株组中,差异蛋白主要富集在TGF-β信号通路、PPAR信号通路、ECM受体相互作用受体通路等。对差异蛋白STING进行Western blot验证,结果与测序趋势一致。综上所述,本试验发现AE17可以通过气管注射的方式感染机体其他器官,m RNA测序结果表明差异表达基因主要富集于细胞因子与细胞因子受体的相互作用、细胞周期通路。成功构建了clp V基因缺失株及回复株,clp V影响APEC的生物学特性;m RNA测序结果表明,△clp V主要通过调节细胞因子与细胞因子受体的相互作用等通路进而影响其对宿主的致病作用。△hcp2a、△hcp2b菌株感染雏鸡气管后,差异表达基因主要富集在细胞因子与细胞因子受体相互作用通路。蛋白质组学测序结果表明,△hcp2a菌株、△hcp2b主要通过调控TGF-β信号通路、ECM受体相互作用受体通路调控进而影响其对宿主的致病作用。