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目的:1.构建针对Smad4基因的RNA干扰的慢病毒表达载体,并使肝癌细胞SMMC-7721中Smad4稳定低表达。2.观察Smad4对肝癌细胞SMMC-7721迁移能力的影响。3.观察Smad4对肝癌细胞SMMC-7721中细胞骨架相关蛋白fascin/cortactin表达的影响,探讨Smad4影响肝癌细胞迁移能力的机制。方法:1.设计16条针对Smad4基因的RNA干扰靶点序列,并设计合成相对应的编码短发卡RNA结构的DNA模板链,经扩增、退火后形成双链DNA,与经Age I和EcoRI酶切后的pMAGic1.0载体连接、转化、并PCR、DNA测序鉴定。2.将慢病毒载体质粒与无内毒素的慢病毒包装系统共同转染293T细胞,包装产生病毒颗粒,病毒浓缩后测定其滴度。3.将包装产生的慢病毒感染肝癌细胞SMMC-7721,通过Western blot检测其干扰效率。根据干扰效率,筛选出干扰效率高的两组细胞进行后续的实验。未经感染的肝癌细胞SMMC-7721和感染慢病毒空载体的肝癌细胞(RNAi-NC)作为后续实验的对照组。4.细胞划痕实验检测Smad4干扰组和对照组的细胞,在0 h、12 h、24 h、48 h划痕愈合的情况。5.三维培养检测Smad4干扰组和对照组的细胞,在三维培养条件下细胞形态的变化。6. Western blot检测Smad4干扰组和对照组的细胞中,细胞骨架相关蛋白fascin/cortactin表达的变化。结果:1. PCR鉴定结果显示,连接入双链DNA片段的阳性克隆PCR片段大小为343 bp;没有连接入的PCR片段大小为306 bp。DNA测序鉴定结果显示,该序列与设计的序列相一致。2.将慢病毒载体质粒与无内毒素的慢病毒包装系统共同转染293T细胞,包装产生的慢病毒颗粒经浓缩后,其病毒滴度为2×108 TU/mL,慢病毒包装成功。3.将包装产生的慢病毒感染肝癌细胞SMMC-7721,检测干扰效率,筛选出干扰效率高的两组,RNAi-Smad4-2组和RNAi-Smad4-12组。Western blot检测显示两组细胞中Smad4蛋白的表达量,与肝癌细胞SMMC-7721组和RNAi-NC组相比减少。4.细胞划痕实验结果显示,相较于肝癌细胞SMMC-7721组和RNAi-NC组,低表达Smad4的RNAi-Smad4-2组和RNAi-Smad4-12组细胞的划痕愈合较快。5. 3D培养结果显示,在三维培养过程中低表达Smad4的RNAi-Smad4-2组和RNAi-Smad4-12组的细胞,其边缘逐渐不规则,向周围凝胶渗入。而SMMC-7721组和RNAi-NC组细胞仍维持原有形态。6.与肝癌细胞SMMC-7721组和RNAi-NC组相比,低表达Smad4的RNAi-Smad4-2组和RNAi-Smad4-12组的细胞中细胞骨架相关蛋白fascin/cortactin表达水平升高。结论:Smad4可以影响肝癌细胞SMMC-7721的迁移能力,这一作用可能与其调控细胞骨架相关蛋白fascin/cortactin的表达有关,这将为临床预测肝癌的早期转移以及肝癌转移的靶向药物的研发提供理论基础。