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目的:构建鲍曼不动杆菌纤连蛋白结合蛋白Omp33-36、Ton B抗原B细胞表位和T细胞表位,检测相应细胞表位的免疫效果,为制备单克隆抗体和研制鲍曼不动杆菌亚单位疫苗奠定基础。方法:运用生物信息学软件Optimum Antigen?Design Tool和IEDB预测纤连蛋白结合蛋白Omp33-36、Ton B蛋白分子小鼠B细胞及T细胞表位并人工合成相应肽段;构建重组质粒p ET30a-omp33-36、p ET28a-ton B,将重组质粒转化入大肠埃希菌BL21,经诱导表达、纯化等步骤获得Omp33-36、Ton B蛋白,通过SDS-PAGE、Western-blot检测Omp33-36、Ton B蛋白在原核细胞中的表达。使用弗氏佐剂作为免疫佐剂,设定蛋白免疫组、PBS对照组,皮下注射免疫BALB/c小鼠,共免疫3次后,收集小鼠血清,ELISA法检测蛋白抗原特异性抗体水平,小鼠血清中针对B细胞表位抗体水平;收集小鼠脾细胞,ELISA法检测经候选T细胞表位体外刺激后脾细胞分泌IFN-γ水平。结果:1.生物信息学方法预测Omp33-36、Ton B蛋白抗原细胞表位结果:根据生物信息学软件预测的结果,得到Omp33-36蛋白B细胞和T细胞表位各3条,得到Ton B蛋白B细胞和T细胞表位各4条,并成功进行了人工合成。2.成功构建了重组质粒p ET30a-omp33-36、p ET28a-ton B,表达、纯化获得相应蛋白:以鲍曼不动杆菌基因组DNA为模板扩增出Omp33-36全长基因约822 bp,Ton B全长基因约753bp,并分别将其克隆入p ET30a(+)、p ET28a(+)载体,构建p ET30a-omp33-36、p ET28a-ton B重组质粒,经PCR、双酶切和测序鉴定证实重组质粒构建成功。诱导表达Omp33-36、Ton B蛋白,SDS-PAGE结果显示Omp33-36蛋白约34k Da,Ton B蛋白约34k Da与理论值符合。3.间接ELISA检测Omp33-36、Ton B蛋白抗原B细胞表位免疫效能,筛选有效B细胞表位:间接ELISA结果显示:肽段Omp33-36B1、Omp33-36B2与Omp33-36蛋白免疫组小鼠血清发生反应,肽段Ton BB3、Ton BB4与Ton B蛋白免疫组小鼠血清发生反应,其OD值显著高于PBS免疫组小鼠(p<0.05),确定其为B细胞表位。4.双夹心ELISA测定小鼠血清IFN-γ量,筛选有效T细胞表位:双夹心ELISA结果显示:肽段Omp33-36T3刺激Omp33-36免疫组小鼠脾脏细胞产生的IFN-γ量显著高于PBS免疫组(p<0.05);肽段Ton BT2、Ton BT3及Ton BT4刺激Ton B免疫组小鼠脾脏细胞产生的IFN-γ量显著高于PBS免疫组(p<0.05);从而确定Omp33-36T3为Omp33-36蛋白有效T细胞表位,Ton BT2、Ton BT3及Ton BT4为Ton B蛋白有效T细胞表位。结论1.通过生物信息学方法,预测了鲍曼不动杆菌纤连蛋白结合蛋白Omp33-36、Ton B抗原B细胞和T细胞表位。2.成功构建了p ET30a-omp33-36、p ET28a-ton B原核表达载体,表达并纯化了Omp33-36、Ton B纤连蛋白结合蛋白,成功免疫小鼠。3.筛选出鲍曼不动杆菌Omp33-36蛋白的2个B及1个T细胞有效表位,Ton B蛋白的2个B及3个T细胞有效表位,为研制鲍曼不动杆菌亚单位疫苗及优化重组DNA疫苗奠定基础。