论文部分内容阅读
羊口疮，是由痘病毒科副痘病毒属的羊口疮病毒感染引起的人畜共患传染病，能引起山羊采食、吮乳困难而影响患羊增重或继发其他感染而死亡，给养羊业造成很大经济损失。许多研究结果显示，体液免疫在羊口疮免疫防御中发挥着很重要的作用。因而建立羊口疮抗体的ELISA检测方法对于羊口疮疫苗的免疫效果评估、羊口疮流行病学调查等有着重要的应用价值。羊口疮病毒表面囊膜蛋白B2L、肝素结合蛋白（F1L）和干扰素连接蛋白（VIR）在不同羊口疮病毒株中高度保守，并能刺激机体产生抗羊口疮病毒的抗体，因而本研究选其作为间接ELISA检测方法的候选包被抗原。本研究根据NCBI中已公布的B2L、F1L和VIR基因序列设计引物，通过PCR进行这三个基因的克隆，并将其与pGEM-Teasy载体连接转化到DH5α感受态细胞中，构建克隆质粒，测序。测序结果使用DNAstar软件分析基因的核苷酸和氨基酸序列，使用SignalPversion3.0预测有无信号肽，使用稀有密码子预测网站预测稀有密码子的含量；将目的基因与pET-32a经双酶切后连接并转化到BL21(DE3)中进行原核表达，获得的可溶性蛋白进行镍柱纯化；分别在家兔脊柱两侧、腹股沟经皮内或皮下接种重组蛋白抗原制备多克隆抗体，并通过Westernblot和琼脂双扩散试验确定获得的目的蛋白能否与其制备的多克隆抗体特异性结合，并通过间接ELISA方法确定抗体效价；分别以表达的蛋白和羊口疮病毒作为包被抗原检测53头份成年羊和已吃初乳的新生羔羊血清，通过比较阳性率确定哪种蛋白作为最佳包被抗原建立羊口疮抗体间接ELISA检测方法，对羊口疮疫情进行监测和进行疫苗免疫效果评估。研究结果如下：1.成功克隆了B2L、F1L和VIR基因，其基因序列全长分别为1137bp、1011bp和552bp。序列分析结果表明，B2L、F1L和VIR基因与NCBI中已公布的基因核苷酸序列相似性分别为96.7%-98.0%、97.3%、94.9%-96.2%，氨基酸序列相似性分别为96.0%-97.9%、91.8%-92.9%、96.7%-97.3%，这四个基因在不同羊口疮病毒中高度保守。2.获得了B2L、VIR基因的原核表达产物。pET32a-B2L-BL21上清在10℃、4h、IPTG0.3mmol/L表达量最高，pET32a-VIR-BL21上清在37℃、11h、IPTG1mmol/L表达量最高；B2L和VIR蛋白多克隆抗体的ELISA效价分别为1:200000和1:100000；Westernblot和琼脂双扩散试验显示，B2L和VIR蛋白能与兔抗羊口疮病毒抗血清和羊口疮病毒阳性血清特异性结合。3.确定了B2L蛋白、VIR蛋白和羊口疮病毒分别作为间接ELISA包被抗原的最佳反应条件，其中B2L蛋白最佳包被浓度为22μg/mL，最佳包被液为碳酸盐缓冲液，一抗最佳作用时间40min，二抗最佳作用时间60min，底物最佳作用时间20min；VIR蛋白最佳包被浓度为30μg/mL，最佳包被液为碳酸盐缓冲液，一抗最佳作用时间40min，二抗最佳作用时间60min，底物最佳作用时间20min；羊口疮病毒最佳包被浓度为106.2TCID50/mL，最佳包被液为碳酸盐缓冲液，一抗最佳作用时间60min，二抗最佳作用时间60min，底物最佳作用时间20min。分别以B2L蛋白、VIR蛋白、羊口疮病毒作为间接ELISA包被抗原检测成年羊和已吃初乳的新生羔羊血清共53头份的结果显示，B2L蛋白与羊口疮病毒的检测结果相同，阳性率为56.6%（30/53），因而成功建立以B2L蛋白作为包被抗原的羊口疮抗体ELISA检测方法。4.通过特异性试验确定重组B2L蛋白与羊痘标准阳性血清、羊口蹄疫标准阳性血清无交叉反应，表明该方法特异性强；通过敏感性试验确定当羊口疮标准阳性血清稀释到1:105时仍为阳性，表明该方法敏感性高；通过批内重复和批间重复检测标准阴阳性血清各1份、待检血清4份，结果显示其变异系数分别为0.23%-4.32%和1.59%-5.83%，小于15%，表明该方法重复性良好；经临床试验表明该方法能检测多个地区的山羊血清和进行疫苗的免疫效果评估。以上结果表明，本实验成功克隆了羊口疮病毒保守性基因B2L、F1L和VIR，获得了B2L和VIR可溶性蛋白，建立了以B2L蛋白为包被抗原的羊口疮抗体ELISA检测方法，能进行羊口疮流行病学监测和疫苗免疫效果评估。