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1.研究背景伊立替康(Irinotecan,CPT-11)是半合成喜树碱衍生物,在体内经CES(羧酸酯酶)转化为活性代谢产物SN-38(7-乙基-10-羟基喜树碱),SN-38是一种强效DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂,抑制DNA单链断裂后的修复,干扰DNA的复制和转录发挥细胞毒作用,主要作用于S期。该药由日本和欧美等国先后在临床进行了试用,1994年在日本首先上市,1998年FDA批准CPT-11化疗方案用于治疗晚期结直肠癌,国内于2009年批准上市。国外的Ⅰ、Ⅱ期临床研究证实,伊立替康对大肠癌、肺癌(非小细胞肺癌和小细胞肺癌)、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、淋巴瘤、乳腺癌、白血病等均有不同的效果,尤其是对大肠癌疗效突出。目前该药也是治疗晚期大肠癌的一线和二线药物。然而,伊立替康具有肠粘膜毒副作用,迟发性腹泻发生率40%,尤其是药物代谢酶UGT1A1基因突变患者发生Ⅲ度以上风险增高,可导致化疗方案中断,危及生命。我们在以68例晚期结直肠癌病人为研究对象的临床观察中发现中药生姜泻心汤可有效预防CPT-11所致迟发性腹泻,尤其是Ⅲ-Ⅵ度腹泻,有效率达100%(0/60例)。未有便秘不良反应发生,CPT-11抗癌有效率与对照组无明显差异,并通过检测外周血T淋巴细胞亚CD4/CD8淋巴细胞等免疫指标,提示提高了肠粘膜免疫功能的作用。另有动物实验,在成功复制CPT-11诱导迟发性腹泻模型的基础上,观察到生姜泻心汤可减轻CPT-11化疗大鼠的腹泻程度,病理学检查,其对化疗后肠粘膜形态学有明显的改善,证明有减轻肠粘膜损伤、促进修复的作用。故本研究通过继续建立CPT-11所致迟发性腹泻大鼠模型,更进一步研究观察大鼠小肠粘膜组织结构及肠功能细胞(杯状细胞、潘氏细胞、内分泌细胞)的变化,以探讨中药生姜泻心汤对CPT-11所致迟发性腹泻大鼠模型肠粘膜损伤修复的机制,阐述生姜泻心汤对CPT-11所致迟发性腹泻的预防作用。2.研究目的通过建立CPT-11所致迟发性腹泻大鼠模型,中药生姜泻心汤预防CPT-11迟发性腹泻模型,以观察生姜泻心汤对伊立替康化疗后大鼠小肠粘膜组织结构及肠功能细胞的变化,以探讨中药生姜泻心汤对CPT-11所致迟发性腹泻大鼠模型肠粘膜损伤修复的机制,阐述生姜泻心汤对CPT-11所致迟发性腹泻的预防作用。3.研究方法健康SD大鼠24只随机分为3组,正常对照组、CPT-11组、中药+CPT-11组,每组8只,每4只1笼饲养。CPT-11组、中药+CPT-11组于实验第4天根据文献Trifan[6]方法建立CPT-11所致迟发性腹泻动物模型：大鼠尾静脉注射CPT-11150mg/kg·只，每天1次,连续2天；正常组予等体积生理盐水尾静脉注射。中药+CPT-11组,于实验第1天,予生姜泻心汤灌胃给药,按成人剂量的7倍,约lOg/Kg·只,每日1次,连续用药9天。正常对照组、CPT-11组等体积去离子水灌胃。末次予CPT-11尾静脉注射后48小时,每12小时对腹泻情况评分,连续观察6次。腹泻评分参考Akinobu Kurita方法：0分：大便正常或没有；1分：轻度腹泻.大便可见轻微湿软；2分：中度腹泻。大便较湿且不成形并且有轻度肛周着色；3分：重度腹泻.水样便并伴有重度肛周着色。记录平均每只大鼠每天进食量,体重,计算各组大鼠注射CPT-11后每天与注射前的差值,以观察注射CPT-11前后进食和体重的变化。各组大鼠于实验第10天处死,距回盲部3cm取回肠、盲肠各3cm、距直肠9cm处取结肠3cm,10%福尔马林液固定,常规脱水、透明、浸蜡包埋、切片厚度4微米。取各组大鼠回肠、盲肠、结肠切片,HE染色,光镜下根据Chiu肠黏膜损伤分级(Ⅰ级：正常黏膜绒毛。Ⅱ级：上皮下间隙增大,通常在绒毛的尖端,常伴有毛细血管淤血。Ⅲ级：上皮下间隙扩张伴随上皮层同固有层中度分离。Ⅳ级：绒毛两侧上皮层大量地同固有层分离,部分绒毛顶端破损。V级：绒毛破损伴随固有层毛细血管暴露,可能观察到固有层的细胞成分增多。Ⅵ级：固有层破坏和不完整,出血和溃疡)。取备用切片,PAS特殊染色显示肠杯状细胞、潘氏细胞；免疫组化CgA染色显示肠内分泌细胞,光镜下拍摄每只大鼠回肠、盲肠、结肠,各取4个视野,图片阳性细胞用Image-Pro-Plus6.0进行累计光密度(IOD)分析,并记录潘氏细胞数目。采用IBM SPSS20.0统计软件,计量资料采用one-way ANOVA分析,方差不齐时采用Kruskal-wallis检验。等级治疗采用Mann-whitneyu检验。所有检验中P<0.05有统计学意义；P<0.01有显著差异。3.研究结果：本实验成功复制CP-11所致迟发性腹泻SD大鼠模型。尽管未出现严重的致死性腹泻,但在初次CPT-11后出现大鼠进食量及体重下降,末次注射CPT-11后48小时出现腹泻,第60-72小时,CPT-11腹泻模型组迟发性腹泻率达100%,中重度腹泻率达87.5%,中药+CPT-11组在末次注射CPT-11后48-60小时偶见轻、中度腹泻,腹泻率仅50%,且从72-108小时后腹泻逐渐恢复,与CPT-11组比较有显著差异(P<0.01)。光镜下观察CPT-11组大鼠回肠、盲肠、结肠均有不同程度的损伤。根据Chiu标准对回肠、盲肠、结肠黏膜损伤程度分级,其中回肠黏膜损伤最轻,损伤分级在Ⅰ-Ⅲ级,盲肠损伤最重,分级在Ⅳ-Ⅵ级,结肠损伤程度在回肠与盲肠之间,分级在Ⅰ-Ⅳ级。中药+CPT-11组与CPT-11组比较,回肠、结肠损伤程度明显改善(P<0.05),盲肠显著改善(P<0.01)。CPT-11组回肠、盲肠、结肠杯状细胞均有凋亡,其中盲肠损伤最严重,结肠次之,回肠最轻。中药+CPT-11组回肠、盲肠、结肠杯状细胞较CPT-11组均有明显改善(P<0.05)。CPT-11组回肠潘氏细胞上皮顶端有脱落、变光滑,细胞面积减少,数量少于正常对照组(P<0.05)。中药+CPT-11组回肠潘氏细胞偶见上皮顶端脱落、变光滑,细胞数量基本正常,较CPT-11组得到明显改善(P<0.05)。注射CPT-11后,CPT-11组回肠腺体内分泌细胞增多,胞浆体积增大,多为开放型,向肠腔释放棕黄色颗粒样物质；盲肠、结肠黏膜上皮凋亡、固有层分解不完整,腺体结构消失,正常卵圆形闭合型、锥体形开放型内分泌细胞凋亡,盲肠仅见少量形状不规则的内分泌细胞,分布于肠上皮及固有层间,结肠隐窝部闭合型、形状不规则的内分泌细胞数量增加。中药+CPT-11组回肠内分泌细胞数量增加,由隐窝部向肠顶端上皮移动,形状不规则,同时可见闭合型与开放型,开放型较多,其细胞数量、面积均小于CPT-11组,但统计学无差异(P<0.05)；盲肠、结肠黏膜上皮顶端有凋亡,卵圆形闭合型内分泌细胞破裂,向肠腔释放棕黄色颗粒状物,隐窝部内分泌细胞基本正常,与CPT-11组比较有明显改善(P<0.05)。中药+CPT-11组在三段肠组织隐窝部均可见新生杯状细胞、潘氏细胞、内分泌细胞。研究结论：生姜泻心汤可有效改善CPT-11化疗所致大鼠进食、体重下降,降低CPT-11腹泻发生率及腹泻程度,可减少肠功能细胞杯状细胞、潘氏细胞、内分泌细胞的坏死、凋亡、促进新生肠功能细胞,从而改善大鼠肠粘膜损伤程度,促进肠粘膜修复,以预防和治疗CPT-11迟发性腹泻。