背景:眼部病理性新生血管的形成是导致失明的主要原因。缺氧是缺血性视网膜病变中促发视网膜新生血管（Retinal Neovascularization）形成的主要因素,其受缺氧部位微环境改变影响。视网膜小胶质细胞与缺氧诱导的血管生成和血管病变密切相关,但其确切机制尚不清楚。缺氧往往伴随着乳酸的产生和堆积,除原有代谢功能外,乳酸可发挥额外的非代谢作用,包括调控巨噬细胞极化、T细胞活化以及促肿瘤生长等。乳酸化修饰（Lactylation）是一种乳酸衍生的新型翻译后修饰（Posttranslational Modification,PTM）,可直接调控基因表达并在多种生命过程中起着关键作用,但其是否参与缺氧诱导的视网膜血管生成尚未报道。本研究旨在探索视网膜小胶质细胞乳酸化修饰在视网膜新生血管形成中的作用及其机制,有望为视网膜新生血管疾病提供新的治疗靶点。第一部分体内体外研究阐明小胶质细胞乳酸化修饰与血管生成的密切关系目的:1.建立C57BL/6J小鼠氧诱导视网膜病变（Oxygen-induced Retinopathy,OIR）模型,探索小胶质细胞乳酸/乳酸化修饰对于视网膜新生血管的影响,探讨清除小胶质细胞逆转OIR视网膜新生血管的可能性。2.建立人小胶质细胞（Human Microglial Clone 3,HMC3）与人视网膜微血管内皮细胞（Human Retinal Microvascular Endothelial Cells,HRMECs）共培养体系,探讨体外缺氧诱导的人小胶质细胞乳酸化修饰对于血管生成的影响。方法:1.动物模型建立,雄性或雌性C57BL/6J幼崽在出生当天被定义为P0,幼崽和哺乳鼠在正常空气环境中按照12/12小时日/夜周期自由地接受食物和水,持续7天（P0-P7）。第7天（P7）时将健康幼崽和哺乳鼠一起放入玻璃氧气室,氧气室氧流量控制在0.50-0.75 L/min,氧浓度保持在75±2%,连续饲养5天（P7-P12）。在第12天（P12）时,将哺乳鼠以及幼崽放回正常的空气环境中继续饲养5天（P12-P17）。PLX3397药物处理组于P10-P17完成腹腔注射（PLX3397为集落刺激因子受体1（Colony Stimulating Factor 1 Receptor,CSF1R）抑制剂）;二氯乙酸钠（Sodium Dichloroacetate,DCA）、鱼藤酮（Rotenone）和二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide,DMSO）化合物处理组于P13-P16完成腹腔注射。幼崽在17天（P17）时被处死,摘除的视网膜用于后续实验。使用乳酸试剂盒检测视网膜乳酸含量,通过蛋白质印迹实验（Western Blot,WB）检测泛乳酸化修饰（Pan Lysine Lactylation,Pan-Kla）水平及采用免疫荧光（Immunofluorescence,IF）实验观察视网膜血管的生成情况。2.以1%浓度O2缺氧HMC3细胞0 hr、12 hrs、24 hrs三个时间。使用乳酸试剂盒检测HMC3细胞三个时间点的乳酸含量,WB检测乳酸化修饰水平。缺氧/常氧预处理的HMC3细胞与HRMECs进行共培养,使用成管、迁移和增殖三个实验检测内皮细胞的功能。此外,HMC3细胞在缺氧24 hrs基础上分别加入DCA、Rotenone和DMSO,使用乳酸试剂盒检测三组HMC3细胞的乳酸含量,WB检测其乳酸化修饰水平;三组化合物处理的HMC3细胞与HRMECs进行共培养,使用成管、迁移和增殖三个实验方法检测内皮细胞的功能。结果:1.建模后,视网膜中小胶质细胞大量增殖并聚集在OIR视网膜新生血管周围。与对照组相比,OIR视网膜中的乳酸含量和乳酸化修饰水平在P17（OIR中新生血管形成的峰值期）中均上调,并且视网膜乳酸化修饰定位于小胶质细胞中。OIR经化合物（DCA、Rotenone）处理后,DCA组视网膜乳酸含量和乳酸化修饰水平降低,而Rotenone组视网膜乳酸含量和乳酸化修饰水平升高,我们观察到DCA处理后模型鼠视网膜新生血管表型得到了一定程度的缓解,而Rotenone组加重了视网膜新生血管的生成。模型鼠施用PLX3397后,随着小胶质细胞的耗竭,视网膜病理性血管生成受到极大抑制,并且随着PLX3397的使用,视网膜乳酸化修饰水平显著下调。2.随着缺氧的发生,HMC3细胞的乳酸含量增加,乳酸化修饰水平也升高,值得注意的是,55-70k D范围的蛋白修饰水平变化尤为明显。随着HMC3细胞缺氧时间的增加,HRMECs的管形成、迁移和增殖能力显著增强。使用DCA和Rotenone处理HMC3细胞,DCA组细胞的乳酸/乳酸化修饰水平显著降低,而Rotenone组乳酸/乳酸化修饰水平显著升高;我们将来自DCA/DMSO/ROT组的HMC3细胞与HRMECs进行共培养,发现与DCA组共培养的HRMECs的管形成、迁移和增殖能力显著减弱,而ROT组内皮细胞功能显著增强。结论:上述结果表明,小胶质细胞中升高的乳酸/乳酸化修饰水平是视网膜新生血管形成的关键因素。第二部分小胶质细胞通过乳酸/p300/YY1乳酸化/FGF2信号通路促进血管生成目的:1.通过乳酸化修饰组学分析发现小胶质细胞在缺氧条件下发生乳酸化修饰水平改变的关键蛋白。2.探索小胶质细胞中转录因子阴阳-1（Yin Yang-1,YY1）乳酸化修饰在调节血管生成中的重要作用。3.探索YY1乳酸化修饰促进血管生成的靶向作用因子。4.通过体内体外研究探索影响YY1乳酸化修饰水平进而调节血管生成的乳酸化修饰调节酶。方法:1.常氧和缺氧分别处理HMC3细胞24小时,然后通过4D无标记平台方法应用乳酸组分析来识别差异乳酸化蛋白。缺氧和常氧条件分别处理HMC3细胞24小时后,免疫沉淀（Immunoprecipitation,IP）两个处理组中的YY1,免疫印迹实验（Immunoblotting,IB）检测YY1相对乳酸化修饰水平。用带有Flag标签的YY1野生型（WT）或YY1突变型（K183R）的c DNA通过慢病毒去转染HMC3细胞,突变过表达YY1第183位赖氨酸（K）为精氨酸（R）,HMC3细胞的突变组（Hypoxia+K183R）和对照组（Hypoxia+WT）与人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）进行共培养,通过成管、迁移和增殖实验观察内皮细胞功能表型是否得到逆转。2.实时荧光定量聚合链式反应（Real Time Quantitative Polymerase Chain Reaction,rt-PCR）用于检测经典血管生成相关因子VEGF,FGF2,MMP9,MMP2,ANGPTL6在体内外的表达,缺氧、药物（PLX3397）和化合物（DCA、DMSO、ROT）处理后WB检测体内外成纤维细胞生长因子2（Fibroblast Growth Factor 2,FGF2）和乳酸化修饰的表达水平。使用TRANSFAC、Harmonizome和Cistrome Data Browser三个数据库探索YY1的潜在靶基因。通过Chip-q PCR、WB和双荧光素酶报告实验验证YY1乳酸化修饰对潜在靶基因FGF2的调控作用。3.WB检测HMC3细胞缺氧处理后几种经典酰化修饰催化蛋白（TIP60,p300和PCAF）和去修饰蛋白（HDAC6和SIRT1）的表达水平,免疫沉淀（IP）YY1与几种经典酰化修饰酶后利用免疫印迹（IB）实验探索两者间是否存在结合;通过双标免疫荧光实验再次验证YY1与p300是否存在结合;p300抑制剂（A-485）以及p300过表达慢病毒处理HMC3细胞,建立HMC3细胞p300低表达和过表达模型,分为Hypoxia+Control组、Hypoxia+A-485（20μM）组、Control组、oep300-WT组。随后WB检测各组乳酸化修饰水平以及IP各组YY1后利用IB检测各个处理组YY1的相对乳酸化修饰水平。OIR造模鼠第14天（P14）向左右眼玻璃体腔分别注射A485（200μM）/DMSO各1μl,于P17收集视网膜样本,通过WB、IP和IB实验检测视网膜乳酸化修饰、FGF2和YY1乳酸化修饰水平;通过免疫荧光观察视网膜血管生成及小胶质细胞乳酸化修饰水平。结果:1.乳酸化修饰组学分析鉴定出小胶质细胞在缺氧情况下67种蛋白（77个位点）乳酸化修饰水平上调/162种蛋白（190个位点）乳酸化修饰水平下调,我们将其定义为差异表达的乳酸化蛋白（Differentially Expressed Lactylated Proteins,DELPs）。对已识别的DELPs进行聚类分析以了解这些乳酸化蛋白的功能,结果显示大多数DELPs在细胞核中发挥作用,并在调节DNA转录中具有一定潜能。使用基因互作/蛋白质互作数据库（STRING）检索发现,DELPs主要在DNA结合过程中发挥作用,通过功能富集分析（Gene Ontology,GO）,并查阅相关文献,YY1引起了我们的关注。结合之前的实验结果,YY1蛋白大小为68k D,它正处于HMC3细胞缺氧以及化合物处理后蛋白修饰水平差异明显的范围内（55-70 k D）。蛋白质组学分析鉴定出YY1中只有一个赖氨酸残基（K183）发生了乳酸化修饰。验证实验发现HMC3细胞YY1乳酸化修饰水平在缺氧条件下大幅度增加,而YY1的蛋白表达水平没有差异。我们通过免疫荧光实验观察到YY1和乳酸化修饰在缺氧HMC3细胞中存在共定位。进行Flag-YY1的IP实验,随后Pan-Kla的IB实验证实HMC3细胞YY1被乳酸化修饰,并且在K183R突变缺氧处理的HMC3细胞中发现YY1的乳酸化修饰水平降低。与WT组相比,与K183R突变处理的HMC3细胞共培养的HRMECs的成管、迁移和增殖能力减弱。2.与对照组相比,OIR小鼠视网膜中FGF2和VEGF的m RNA水平显著升高,造模鼠在给予PLX3397后,只有FGF2在m RNA和蛋白质水平上均显著降低;HMC3细胞暴露于缺氧12小时内增加了FGF2 m RNA的表达,并且水平持续升高至24小时。使用DCA和Rotenone处理OIR模型于P17天观察,视网膜中FGF2的m RNA和蛋白质水平在DCA组中降低,而在Rotenone组中升高;体外缺氧的HMC3细胞暴露于DCA或Rotenone中发现了与体内一致的结果。HMC3细胞YY1乳酸化修饰位点发生突变后,我们检测到细胞中随着YY1乳酸化修饰水平降低,FGF2的m RNA和蛋白质水平也随之降低。根据三个数据库,我们发现YY1可能直接与FGF2的启动子结合。通过JASPAR网站我们发现FGF2启动子中三个潜在的YY1结合位点,HMC3细胞Ch IP-q PCR结果显示YY1可以与FGF2转录起始位点上游的-1336至-1172 bp区域结合。应用双荧光素酶报告实验验证了HMC3细胞中YY1在缺氧条件下直接促进FGF2转录,而YY1的乳酸化修饰位点突变导致其转录能力降低。3.缺氧条件下HMC3细胞中p300、HDAC6和SIRT1蛋白水平显著上调,TIP60轻度上调。根据免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）结果显示,只有p300与靶蛋白YY1发生结合;双标免疫荧光实验再次证实p300与YY1的结合关系。我们在HMC3细胞中过表达p300,发现乳酸化修饰水平显著升高,FGF2蛋白水平也上调。A-485处理HMC3细胞后,细胞的乳酸化修饰水平明显降低,FGF2的表达水平也下调。通过IB实验检测到,HMC3细胞过表达p300增加了YY1乳酸化修饰水平,而在A-485处理组中观察到HMC3细胞YY1乳酸化修饰水平降低。与相应的对照组比,与过表达p300的HMC3细胞共培养的HRMECs的管形成、迁移和增殖能力增强,而在A-485组中内皮细胞的功能减弱。我们发现在OIR视网膜中p300的表达上调,而没有观察到YY1蛋白本身差异。造模后IP视网膜中的YY1,随后通过IB实验发现OIR视网膜中YY1呈现高乳酸化修饰水平。在OIR P14应用A-485于玻璃体腔内给药,给药后视网膜的乳酸化修饰水平和FGF2表达均降低;OIR经过A-485处理后,IB实验检测到YY1乳酸化修饰水平降低。结论:我们的研究发现了视网膜血管生成新的调节机制-缺氧通过上调p300的表达导致小胶质细胞YY1乳酸化修饰的升高,进而增强FGF2的转录及表达,从而促进HRMECs的血管生成。