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目的研究Daxx与HPV16E6蛋白相互作用的氨基酸结构域,分析宫颈癌细胞内PML和Daxx勺定位,为进一步研究高危型HPV16和HPV18的致癌机制奠定试验基础。方法(1)用PRIMER5.0软件分别设计Daxx基因片段(氨基酸1-240、241-500、501-625和626-740)特异性引物,并引入NdeI和Sa1I酶切位点,PCR扩增目的基因。分别经NdeI和Sa1l双酶切PCR产物和质粒pGBKT7,纯化回收酶切产物,T4连接酶连接后,转化E.coli JM109,筛选阳性克隆。对重组质粒进行酶切鉴定及DNA序列分析。(2)应用LiAC法,分别将诱饵质粒pGBKT7、pGBKT7-Daxx、pGBKT7-Daxx-DM1-240、 pGBKT7-Daxx-DM241-500、pGBKT7-Daxx-DM501-625、pGBKT7-Daxx-DM626-740与猎物质粒pGADT7和pGADT7-E6转化酵母菌AH109,涂布于SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-His、 SD/-Ade(单缺)固体培养基上,30℃培养2-4d,检测诱饵质粒和猎物质粒对酵母菌AH109的自激活作用。(3)将质粒分为8组,它们分别是A组(pGADT7+pGBKT7)、B组(pGADT7-T+pGBKT7-Lam)、C组(pGADT7-T+pGBKT7-p53)、D组(pGADT7-E6+pGBKT7-Daxx)、E组(pGADT7-E6+pGBKT7-Daxx-DM1-240)、F组(pGADT7-E6+pGBKT7-Daxx-DM240-500)、G组(pGADT7-E6+pGBKT7-Daxx-DM501-625)和H组(pGADT7-E6+pGBKT7-Daxx-DM626-740)。(?)每组质粒共转化酵母菌AH109,转化菌分别接种于SD/-Trp-Leu(二缺陷)固体培养基,30℃培养2-4d,待平板上长出菌落后,接种单个菌落于SD/-Trp-Leu-His(三缺陷)和SD/-Trp-Leu-His-Ade(四缺陷)平板上,30℃培养2-4d,观察酵母菌的生长情况,分析Daxx与HPV16E6相互作用的氨基酸结构域。(4)分别以抗Daxx抗体或抗HPV E6抗体对转染pcDNA3.1(-)/HPV16E6(?)的Hela细胞进行免疫共沉淀分析,确定HPV16E6与Daxx在细胞内是否存在相互作用。(5)分别培养HeLa细胞和Caski细胞,利用间接免疫荧光实验,在激光共聚焦显微镜下观察并分析PML和Daxx在细胞内的定位；分析Caski细胞中Daxx与HPV16E6蛋白定位。结果(1)DNA测序结果显示Daxx基因片段(氨基酸1-240、241-500、501-625和626-740)分别正确地连接入pGBKT7载体,即成功构建了重组质粒pGBKT7-Daxx-DM1-240、 pGBKT7-Daxx-DM241-500、pGBKT7-Daxx-DM501-625和pGBKT7-Daxx-DM626-740。(2)转化了诱饵质粒pGBKT7、pGBKT7-Daxx、pGBKT7-Daxx-DM1-240、pGBKT7-Daxx-DM241-500、pGBKT7-Daxx-DM501-625和pGBKT7-Daxx-DM626-740的酵母菌AH109,在SD/-Trp固体培养基上可见菌落生长,而在SD/-Leu、SD/-His、SD/-Ade未见菌落生长。转化了猎物质粒pGADT7、pGADT7-E6的酵母菌AH109,在SD/-Leu固体培养基上可见菌落生长,SD/-Trp、SD/-His、SD/-Ade培养板上未见菌落生长,即诱饵质粒和猎物质粒均无自激活作用。(3)A-G组质粒转化的酵母菌在SD/-Trp-Leu (二缺陷)平板上均可见菌落生长。在SD/-Trp-Leu-His(三缺陷)和SD/-Trp-Leu-His-Ade(四缺陷)平板上,只有C、D、H组转化菌生长,A、B、E、F、G组未见菌落生长。(4)细胞内免疫共沉淀结果显示,在用抗Daxx抗体沉淀Daxx的同时,HPV16E6蛋白一同被沉淀；而用抗HPV E6抗体在沉淀E6蛋白的同时,Daxx也一同被沉淀,即HPV16E6与Daxx在Hela细胞内发生了结合反应。(5)在Caski细胞,HPV16E6和Daxx在细胞核中的分布不均匀,呈区域性聚集；表达红色荧光蛋白的HPV16E6与表达绿色荧光蛋白的Daxx重叠成黄色信号,即两者在Caski细胞中有共定位。(6)在HeLa细胞和Caski细胞,PML红色信号和Daxx绿色信号在胞核和胞浆呈弥散样均匀分布；Daxx绿色信号与PML红色信号重叠时,依然显示各自的绿色信号与红色信号。结论(1)构建的重组体pGBKT7-Daxx-DM1-240、pGBKT7-Daxx-DM241-500、pGBKT7-Daxx-DM501-625和pGBKT7-Daxx-DM626-740能在酵母菌中表达目的蛋白。(2)Daxx通过C端115个氨基酸残基与HPV16E6蛋白结合；HPV16E6与Daxx有相互作用。(3) Daxx与HPV16E6蛋白在Caski细胞共定位于胞浆与胞核。(4)在Caski细胞和HeLa细胞,PML和Daxx在PML-NBs不发生共定位。