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副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是全世界养猪业出现的导致新生仔猪死亡的主要病原之一,近年来,副猪嗜血杆菌杆菌病已经给全世界养猪业带来巨大经济损失。HPS可作为一种常在菌定殖在猪体的上呼吸道,但是在特定条件下可以侵入机体并且导致严重的全身性疾病,以纤维素性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征,但是参与全身感染的毒力因子及其致病机制仍旧没有研究清楚。自转运蛋白是革兰氏阴性菌V型分泌系统分泌的蛋白,研究发现它可以抑制细胞的吞噬作用以及抵抗补体介导的杀伤,帮助菌体克服宿主的天然免疫。HPS中已发现与毒力相关的三聚体自转运蛋白(VtaA),发现其在HPS中表现出多样性,并且是很好的疫苗候选抗原。为了研究自转运蛋白在抵抗补体介导的杀伤即血清抗性方面可能起到的作用,本论文以副猪嗜血杆菌SH0165中发现的自转运蛋白基因at2为研究对象,将at2基因进行缺失,然后利用野生菌株和基因缺失株一同进行血清杀菌试验,来探究at2基因在HPS血清抗性中的作用。具体内容如下：1电转化法筛选at2-pd基因缺失株根据同源重组的原理将at2基因的passenger domain即at2-pd基因的上下游同源臂连接到温敏质粒pSHK3TS上,将重组质粒电转入副猪嗜血杆菌SH0165中,利用温敏质粒在30℃复制而在41℃不复制的特性,调节温度控制质粒的复制,达到筛选缺失株的目的。此方法只得到了发生单交换的菌株,没有筛选到发生第二次单交换的基因缺失株。2表达纯化AT2-PD蛋白,体外加入蛋白进行血清杀菌试验用SH0165和HPS标准血清型7型菌株(HS1073)一同进行血清杀菌试验,发现SH0165具有血清抗性,而HS1073很容易被血清杀伤。试图用HS1073来充当基因缺失株的角色,体外加入AT2-PD进行血清杀菌试验。利用at2-pd表达菌株表达AT2-PD蛋白并将表达出的65KDa大小的蛋白进行纯化。在没有血清抗性的HS1073与5%健康猪血清进行血清杀菌试验时加入40μg/mL的AT2-PD蛋白一同作用,从体外加入蛋白方面来阐述AT2-PD在血清抗性方面的作用。最终试验结果说明体外加入AT2-PD蛋白能够显著提高HS1073抵抗血清杀伤的能力。但是此试验方法存在其不足之处,需继续筛选基因缺失株来明确试验结果。3改变方法筛选at2基因缺失株尝试接合转移的方法进行筛选：将at2-pd基因上下游同源臂连接到自杀性质粒pRE112上,将重组质粒转化入其受体菌大肠杆菌x7213中,x7213和SH0165进行接合转移,利用Cm抗性平皿进行筛选。经过多次接合转移均未成功,后试验验证cm抗性基因不能在SH0165中发挥作用,故放弃此筛选方法。最后采用自然转化方法进行筛选：将at2基因上下游同源臂两端加上USS序列(ACCGCTTGT),上游和下游同源臂中间连接gm抗性片段,命名为UGD,将UGD片段连接到自杀性质粒pK18mobsacB上,重组质粒与41株HPS菌株进行自然转化,利用Gm抗性进行筛选。最终得到了两株at2基因缺失株：CF7066-△at2和WH7111-2-△at2,经过PCR、Western blot和Southern blot等方法鉴定at2基因的缺失。4用at2基因缺失株和野生菌株进行血清杀菌试验得到了at2基因缺失株后,用CF7066和CF7066-△at2一同与90%的健康猪血清进行血清杀菌试验,试验结果表明与SH0165相比,副猪嗜血杆菌CF7066野生菌株抵抗血清杀伤的能力较弱,并且基因缺失株和野生菌株存活率并没有显著的差异,说明at2基因在CF7066菌株的血清抗性方面没有发挥作用。综上所述,对于HPS基因缺失的方法经过了长时间的摸索,最终利用自然转化法得到了CF7066和WH7111-2的at2基因缺失株；筛选到缺失株之前,体外加入AT2-PD蛋白后HS1073抵抗血清杀伤的能力有显著提高,这说明at2基因与HPS的血清抗性相关,但此试验存在其不足之处；而用at2基因缺失株和野生菌株进行血清杀菌试验发现两者存活率并没有显著的差异,说明at2基因在HPS血清抗性方面没有发挥作用。近期研究发现HPS多个基因与血清抗性有关,缺失这些基因后HPS菌株血清抗性显著下降,综合本论文试验结果我们认为at2基因与HPS血清抗性的相关性不大。我们可以利用at2基因缺失株探究自转运蛋白在HPS其它方面的功能。