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目的:探讨脊髓神经元机械损伤后调控PI3K/AKT/mTOR通路介导的自噬和线粒体凋亡之间关系。方法:(1)清洁级孕16天SD大鼠,用于脊髓神经原代细胞培养,细胞培养至第7天按照阙海萍方法建立体外神经元机械损伤模型;(2)普通光学显微镜观察神经元细胞生长状态,利用神经元特异性抗体TUBB3、NSE鉴定神经元纯度;(3)在损伤后不同时间点(1h、4h、8h、24h)收集胞浆蛋白,western blot分析自噬(LC3)和凋亡相关蛋白(caspase-3、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、cytochrome c);(4)TUNEL法检测不同实验组(control、SCI、SCI+LY294002、SCI+BAF)神经元细胞凋亡水平;(5)JC-1试剂盒检测各实验组线粒体膜电位水平;(6)AO染色检测各实验组神经元机械损伤后自噬溶酶体表达情况;结果:(1)通过普通倒置显微镜连续观察培养的神经元细胞,可见神经元胞体较小,并有突触形成。免疫荧光鉴定结果显示,大部分神经元均可被标记,神经元纯度较高。(2)损伤后诱导凋亡:JC-1荧光染色显示,在神经元损伤后8h线粒体膜电位出现明显降低(p<0.05);线粒体凋亡蛋白Bax、cytochrome c、cleaved caspase-3在损伤后8h出现明显增加(p<0.05);抗凋亡蛋白Bcl-2则在损伤后1h表出现表达高峰,随后开始降低;(3)损伤后诱导自噬:western blot结果显示,神经元损伤后4h便开始出现增加,24h达到高峰水平(p<0.05);运用Bafilomycin A1干预后能减少自噬水平发生;(4)AO染色结果显示,对照组胞浆中红色荧光较弱,随着损伤时间增加,在损伤后4h,胞浆中红色荧光出现增加(p<0.05),24h后胞浆中红色荧光最强。(5)PI3K/AKT/mTOR信号通路:western blot结果显示,神经元损伤后1h AKT磷酸水平出现明显增加,4h后达到高峰水平(p<0.05),其下游mTOR磷酸化水平1h后出现明显增加,4h达到高峰(p<0.05);在损伤后24h给予PI3K抑制剂LY294002后,下游AKT及mTOR磷酸水平受到抑制,其自噬水平则出现明显增加(p<0.05);(6)TUNEL结果显示,给予LY294002后细胞凋亡水平较单纯损伤组有明显降低(p<0.05)。结论:(1)神经元机械损伤后能诱导自噬和凋亡发生,并且自噬发生水平早于凋亡;(2)脊髓神经元机械损伤后通过PI3K/AKT/mTOR信号通路介导自噬,抑制该信号通路磷酸化水平能增强自噬并减少细胞凋亡;